鹅坦布苏病毒非结构蛋白NS1原核表达及初步纯化.pdfVIP

鹅坦布苏病毒非结构蛋白NS1的原核表达及初步纯化 赵冬敏黄欣梅刘宇卓张敬峰韩凯凯谢星星周晓波李 银 江苏省农业科学院兽医研究所，农业部兽用生物制品工程技术重点实验室，国家兽用生物制品工程技术研究中心，江苏南京210014 [摘要]根据鹅坦布苏病毒JS804株非结构蛋白NS1基因序列，设计一对特异性引物，利用PCR方法扩增得到完整的 NS1基因，并将其克隆至原核表达载体pET28a和pET32a上，构建出重组表达质粒pET28a-NS1和pET32a-NS1，转化至BL21 (DE3)中，经IPTG诱导得到NS1融合蛋白(His-NS1)，其分子质量约分别为44kD和58kD，均在诱导后6h达到表达量高峰。 分析显示两种融合蛋白均以包涵体形式存在，包涵体经过变性和复性后均可获得单一、高表达量的目的蛋白，为进一步开展 关于鹅坦布苏病毒NS1蛋白的研究奠定了基础。 中国畜牧兽医学会禽病学分会第十六次学术研讨会论文集 液体培养基，37。C振荡培养至OD咖值达0．3-0．4，细胞表面，或者以可溶性的糖基化方式释放到细胞 上清中。研究发现黄病毒属病毒分泌型NSl蛋白 以终浓度1mMIPTG诱导表达，分别于诱导后2、3、 4、5、6h取菌液，离心后取沉淀进行SDS—PAGE电泳可随血液进行循环，针对NSl蛋白这一特性，建立 观察结果。 了多种针对NSI蛋白的ELISA检测方法，应用于坦 1．5莺组NSl蛋白包涵体的纯化将经IPTG诱布苏病毒感染的早期诊断以及在多种黄病毒共流行 导6h的菌液离心后取沉淀，超声波破碎后离心收集 地区的鉴别诊断。目前普遍认为NSl可做为坦布 沉淀，洗涤后再离心，沉淀用包涵体裂解液裂解，离 苏病毒感染诊断中另一种潜在的诊断标志物。 M、2M、0 心取上清液逐级在6M、4 M的尿素中进行 均成功表达出大量的鹅坦布苏病毒NSl蛋白。表 透析，每个浓度12h。终产物进行SDS—PAGE电泳 检测。 达的目的蛋白虽以包涵体形式存在，但是通过简单 2结果与分析 的包涵体变性和复性等纯化步骤后均可获得高表达 2．1结果 量、单一的目的蛋白，同时由于两个载体均携带有 2．1．1 NSl基因的扩增与重组表达质粒的构建 His标签，易于利用商品化镍柱对其进行纯化。 以坦布苏病毒JS804全基因为模板，PCR扩增出 参考文献 lkb左右的片段，与预期大小相符。重组质粒 CM．Geneticofthe I和SalI酶切鉴 [1]MuylaertIR，GallerR，Rice analysis yellow pET28a．NSl、pET32a—NSl经EcoR feverviresNSI ofa 定符合预期。 protein：identification mutationwhichblocksRNA accumulation．JVital。1997。71 2．1．2 NSl蛋白的诱导表达与SDS—PAGE分析 (1)：291-298． mM 表达菌经1 IPTG诱