茶树实时荧光定量PCR分析中内参基因的选择.pdfVIP

植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2010, 45 (5): 579–587, doi: 10.3969/j.issn.1674-3466.2010.05.007 ·技术方法· 茶树实时荧光定量PCR分析中内参基因的选择 1 2 1 1 2* 1* 1 2 孙美莲 , 王云生 , 杨冬青 , 韦朝领 , 高丽萍 , 夏涛 , 单育 , 骆洋 1安徽农业大学农业部茶叶生物化学与生物技术重点实验室, 合肥 230036 2 安徽农业大学生命科学学院, 合肥 230036 摘要 选择合适的内参基因是提高实时荧光定量PCR分析(qRT-PCR)准确性的先决条件。该文以茶树(Camellia sinensis) 芽、叶、幼根、嫩茎、花瓣、种子和愈伤组织为材料, 应用实时荧光定量PCR技术, 分析了18S rRNA、GAPDH、β-actin 和α-tubulin 4个常用内参基因在茶树不同器官组织中的表达情况。经GeNorm和NormFinder软件分析发现, 当利用荧光定 量PCR分析比较茶树不同器官组织中的基因表达差异时, 可选择β-actin作为校正内参基因; 而比较不同成熟度的叶片和愈 伤组织时, 可以选择GAPDH作为校正内参基因。 关键词 茶树, 实时荧光定量PCR, 内参基因 孙美莲, 王云生, 杨冬青, 韦朝领, 高丽萍, 夏涛, 单育, 骆洋 (2010). 茶树实时荧光定量PCR分析中内参基因的选择. 植 物学报 45, 579–587. 实时荧光定量PCR(real time fluorescence qua- 织、细胞和各种实验因素条件下均恒定表达。然而, 近 ntitative PCR, qRT-PCR)实现了聚合酶链式反应技 年来大量的研究结果表明, 并没有表达绝对稳定的基 术(polymerase chain reaction, PCR)从定性到定量 因, 任何一种管家基因的所谓恒定表达都只是在一定 的飞跃, 具有重复性好、灵敏度高、定量准确、速度 类型的细胞或实验因素作用下“有范围”的恒定 快等优点, 已成为分子生物学研究中分析基因表达的 (Andersen et al., 2004; 张艳君等, 2007)。随着对定 重要工具(Heid et al., 1996; Haller et al., 2004; 量要求的不断提高, 为了得到更可靠的实验结果, 实 Ransbotyn and Reusch, 2006; Yoo et al., 2009) 。 验中需要选择较为合适的1个或多个内参基因进行 qRT-PCR技术不仅应用于转基因产品的检测(Libault 校正。 et al., 2008), 而且在医药等许多领域中也得到广泛 茶树(Camellia sinensis (L.) O. Kuntze) 中含有 应用(Boxus et al., 2005; Chain et al., 2005; 丰富的次生代谢产物, 如多酚类物质、生物碱、维生 Etschmann et al., 2006)。利用qRT-PCR方法计算基 素、多糖、挥发油和矿物质(Hertog et al., 1993; Park 因相对表达量时, 通常需引入一个表达较为稳定的管 et al., 2004), 具有抗氧化、抗菌、抗病毒和抗过敏等 家基因作为内参基因(reference gene)( 吴文凯等, 一系列药理功能(Cabrera et al., 2006; Ho et al., 2009) 。在植物学研究中, 常用的稳定表达的管家基 2009; Ko et al., 2009) 。目前, 利用分子生物学研