高渗处理对根癌农杆菌介导转化平菇菌丝体的影响.pdfVIP

食用菌学报@2010．17(1)：6～9 文章编号：1005—9873(2010)01—0006—04 高渗处理对根癌农杆菌介导转化平菇茵丝体的影响 任艳，黄玉杰，张新建，杨合同’ (山东省科学院生物研究所，山东省应用微生物重点实验室，山东济南250014) 摘要：采用根癌农杆菌(Agrobacterium ostreatus)菌 tumefaciens，EHAl05菌株)介导法，对平菇(Pleurotus 丝体遗传转化的最佳试验条件进行研究，结果表明：当平菇菌丝体与甘露醇和山梨醇的混合液预处理20rain， 且与农杆菌共培养60min时，转化效率高且用时较少。经PCR和Southern Blotting检测表明，转移DNA (transferred DNA，T-DNA)中的潮霉素抗性基因hph已整合到转化子基因组中。 关键词：平菇；根癌农杆菌；hph基因；高渗；共培养 平菇(Pleurotusostreatus)作为一种食用真 1材料和方法 菌，在我国得到广泛栽培，但是由于平菇品种长 期无性繁殖致使菌种退化、产量降低，而传统的 1．1供试菌株与质粒 育种技术存在着周期长、见效慢、不稳定等问 平菇(Pleurotus 题，因此迫切需要探索更高效、稳定的育种方 东省农业科学院万鲁长老师赠送；根癌农杆菌 法。基因工程技术的发展为菌种选育开辟了一 (Agrobacterium 条新途径，1998年，DEGROOT等首先把农杆中国农业大学张力群老师惠赠；含有潮霉素抗性 菌介导法应用于真菌的遗传转化，以真菌的分 生孢子和菌丝为受体，成功地将T．DNA转入泡微生物重点实验室保存。 1．2培养基 盛曲霉(Aspergillusawamori)、哈茨木霉 (Trichodermaharziamum)、粗糙脉胞菌PDA培养基(／L)：马铃薯200 g，葡萄糖 15 (Neurosporacrassa)和双孢菇(Agaricusg，琼脂15g。 bisporus)中n3；CHEN等利用改进的农杆菌介PDA选择培养基(／L)：PDA培养基中加入 导法对双孢菇子实体进行转化并获得成功。23； 不同浓度的潮霉素(Sigma公司)。 2001年，THOMAS等同样用农杆菌转化了双孢LB液体培养基(／L)：胰蛋白胨10 g，NaCI 菇的菌丝体和担孢子萌发菌丝，获得了稳定的 10 7．O～7．5。 g，酵母提取物5g，pH 转化子[33；但上述方法中转化效率相对较低，获 LB固体培养基(／L)：LB液体培养基中加入 得的转化子大部分不稳定。在传统的基因枪遗 15 g琼脂。 传转化方法中，许多植物及外植体在轰击转化 LB诱导培养基(／L)；LB液体培养基中加入 前经渗透处理都有助于提高转化效率[4。]，因 乙酰丁香酮(AS，溶于二甲基亚砜中，工作浓度为 此，山东省应用微生物重点实验室通过对平菇 200#mol／L)。 菌丝体进行高渗处理以及与农杆菌共培养时间 共培养诱导培养基(／L)：葡萄糖5