多重PCR技术检测小管福寿螺(Pomacea+canaliculata)体内广州管圆线虫幼虫方法研究.pdfVIP

多重PCR技术检测小管福寿螺(Pomacea 内广州管圆线虫幼虫的方法研究 危芙蓉，张仪 (中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所卫生部寄生虫病原与媒介生物学重点实验 室，上海，200025) 病是一种以暴发形式出现的食源性寄生虫病，一旦发生暴发或有疑难，需要快速检测、快速 控制的方法，以提升疾病控制能力，为深入防治工作提供科学依据和手段。在我国，小管福 寿螺是广州管圆线虫的重要中间宿主。目前，对于检测小管福寿螺体内广州管圆线虫感染的 检测方法主要是基于显微镜的病原学检测，包括直接沉淀镜检法、胃蛋白酶消化法和螺肺检。 由于广州管圆线虫Ⅲ期幼虫(L3)相对与小管福寿螺体积相对较小，这些检测方法对检测 者知识和技术要求较高，在低感染度和早期感染的情况下漏检率高。PCR方法现已广泛应 用于检测各个领域，并可达一定的敏感性与特异性。本研究拟建立一种以PCR为主的分子 生物学检测方法，以补充现有的病原学检测方法，并应用于现场检测，以达快速目的。 组织中DNA的抽提是开展PCR方法研究的前提。因软体动物自由生活于各种环境中， 其软体部分可直接暴露于环境，会被外界生物(如病毒、细菌、原生动物等)感染或被环境 中的有机物质和无机物质而污染。此外软体动物富含脂类、多糖、蛋白质，这些物质皆为 PCR反应的抑制物，快速有效的抽提方法是PCR研究的基础。通过比较常规厂家OMEGA、 QIAGEN和天根的基因组DNA抽提试剂盒，及常规DNA抽提法：异硫酸氰胍抽提法、树 脂抽提法和树脂．二氧化硅抽提法，发现OMEGA公司的基因组DNA抽提试剂盒的提纯效 果最好，适用于少量样本的抽提。树脂．二氧化硅抽提法抽提法从提纯效果、成本等方面评 价，较适用于大量样本抽提处理工作。异硫酸氰胍抽提法，操作时间短，成本低但所用试剂 对身体有害，较适用于大量样本或应急样本的处理。开展检测工作时，需根据具体情况选择 适宜的抽提方法。 基于多重PCR方法可在一次反应中同时扩增多条目的序列的优点，本研究在PCR反应 体系中加入一对已报道扩增小管福寿螺16srDNA序列的引物用于控制由于外界因素造成的 PRIMER 假阴性情况的出现。同时，从NCBI中获取广州管圆线虫基因序列信息，通过NCBI Premier BLAsT获取特异性较高的引物，Primer5软件对选取的引物进行评价后经过多重筛 选，选出一对特异性扩增广州管圆线虫核糖体小亚基上一段长约405bp左右序列的引物。运 用以上两对引物建立的多重PCR检测方法在敏感性达到50l。检测153只野外采集的 pg／u 福寿螺，此方法与肺检法相比较，敏感度和特异度分别为93．8％、95．2％。在小管福寿螺体 内检测广J,i·I管圆线虫上具有一定的应用价值。 关键词：广州管圆线虫；提纯；多重PCR；检测；小管福寿螺 135