猪PNAS-4基因启动子调控特征研析.pdfVIP

第十五次全国动物遗传育种学术讨论会论文集 猪PNAS一4基因启动子调控特征分析 谢莹，莫德林，陈瑶生 有害生物控制与资源利用国家重点实验室，中山大学，广州510006 关键词：猪；PNAS．4；启动子 引言 研究猪胚胎期骨骼肌生长发育规律的工作中，发现该基因在胚胎期呈下调表达模式，而在出生后呈上调表， 且有研究报道该基因与细胞凋亡有关。另外该基因在各组织中存在表达量的差异，其中，骨骼肌和淋巴组织 中表达量最高，肾和大脑中表达量最低，然而截止目前，该基因的功能仍然不是很清楚。本研究拟从PNAS一4 的启动子研究着手，分析其转录调控特征，从而进一步探讨该基因的功能。 材料方法 通过同源比对获得含有猪PNAS一4基因5’侧翼序列的片段信息，然后克隆、测序得到猪PNAS一4基因的 启动子。利用巢式PCR，结合常规分子生物学技术手段，构建双荧光素酶启动子系列缺失重组载体，并分别 转染不同的哺乳动物细胞，以准确检测启动子各缺失片段的活性。确定启动子活性最高的片段，锁定关键区， 应用TESS在线预测转录因子结合位点，用多位点突变试剂盒对转录因子结合位点进行多点突变，检测突变 后片段活性，从而找出影响片段活性最关键的结合位点。 结果 包含一个GC岛(翻译起始密码子的A设为+1)。利用巢式PCR分别得到长度相差300 bp左右的6个缺失片 Mithras 的胎儿成纤维细胞PEF。利用BertholdLB940多功能酶标仪检测荧光值，发现虽然细胞系不同，但各 缺失片段在同一细胞系中的活性大小的趋势一致，即三种细胞系中F2(．473．．+9)片段活性相对于Fl (一18M)片段都有显著提高，但与其它片段的活性差异不显著。鉴于F2片段所处启动子的位置，于是锁 定F2可能有影响该基因表达的核心转录元件，应用TESS预测该区域可能的转录因子结合位点，发现该区域 变，但每一个单点突变都不能使得所在片段的转录活性得到显著降低。 讨论 定程度上说明猪的PNAS．4基因的转录可能受甲基化作用的影响。将启动子系列缺失片段构建的双荧光素酶 报告基因载体分别转染三种不同的细胞系，发现这些启动子系列缺失片段在不同的细胞系中的活性趋势一致， 只是荧光值的大小不同而已，一方面说明同一启动子中不同片段的活性差异相对一致；另一方面说明不同细 胞系由于具有相同的转录因子，因此对各片段的活性大小有着相同的影响。三种细胞系较一致地确定了F2片 段为该基因重要转录因子所在的区域，利用单点突变确定关键结合位点时，发现单点突变并不能使得所在片 段的转录活性显著下降，说明可能该基因的转录并不是单一位点起作用，而是多个位点综合作用的结果。 致谢 本研究受中国博士后科学基金(20080430804)和广东省自然科学基金的资助。 一322—