卵子突变基因在小鼠早期胚胎发育过程中作用机理的研究.pdfVIP

细胞工程与转基因 卵子突变基因在小鼠早期胚胎发育过程中作用机理研究 宋根娣，柴保国，赵卫东，李春丽，郑振宇 河南农业大学牧医工程学院动物遗传工程实验室，郑州450002 关键词：小鼠；卵子突变基因；RT-PCR；早期胚胎 引言 卵子突变基因(ovummutant或Om)是在实验用近交系小鼠中发现的一种能够导致早期发育胚胎致死的等 位基因。携带Om基因的DDK品系雌鼠与其它近交系雄鼠交配时则表现出极性不育现象。基于卵子细胞质移 植和受精卵前核移植实验的证明，DDK卵子突变基因Om介导产生的一种RNA分子，该分子能够与非DDK 品系同一位点控制产生的精子因子之间产生不亲和性，进而导致胚胎早期死亡。本研究基于以上研究基础上， 通过检测不同交配组合小鼠胚胎发育早期各时期细胞中存在的基因表达差异，旨在揭示卵子突变基因在小鼠 早期胚胎发育过程中的作用机理，完善小鼠胚泡形成过程中分子调控相关理论。 材料方法 两种交配组合正常方式交配。通过对已知影响小鼠早期胚胎发育基因的研究分析，筛选出8个候选基因，所 选基因在小鼠胚胎中非正常表达能够导致与Om基因引发相似的早期胚胎致死现象。以Genbank登陆的基因 序列为基础，跨内合子设计候选基因引物。观察采集早期胚胎细胞(2细胞期至囊胚期)，提取RNA并进行 的灰度(每个个体重复3次)，用候选基因条带灰度与15-actin灰度之间求比值，半定量检测候选基因在不同交 配组合小鼠胚胎细胞中的表达情况。 结果 胚胎学观察表明，杂交组合中胚胎细胞发育至8．细胞期后，即桑葚期开始已经发生严重的凋亡现象，不 能采集足够有效样本进行后续试验，因此，采取2一细胞至8．细胞期胚胎进行候选基因检测；候选基因扩增产 EGF．R，Bcl．2基因除2细胞 物电泳结果表明，LIF在各个时期内均未检测到表达；H—las，TGF一Ⅱ，C．myc， 期未检测到外，其他时期胚胎细胞中均有表达；Mcl．1，EGF在三个时期内均检测到表达。SAS分析结果表明， (PO．01)，候选基因在不同交配组合小鼠的早期胚胎发育过程中表达存在差异，并且差异表达基因在杂合 胚胎中呈下调趋势。 讨论与结论 基于对Om基因研究的相关结论分析：Orn基因可能是通过母源RNA分子对其它影响早期胚胎发育的功 形成过程中)的间接修饰，使其不能正常表达或者不能正常作用于胚胎发育，进而导致胚胎致死。本研究通 x 过对正常交配方式下杂交组合(DDK9BALB／C艿)与正交组合(DDK早×DDKd)tJ,鼠胚胎发育早期受精 卵的采集观察，发现杂交组合中胚胎发育至8细胞期后(桑葚期开始)已经发生细胞凋亡。因此，Om导致的 细胞致死现象是从桑葚期已经开始发生的一种胚胎细胞凋亡现象。小鼠作为高等哺乳动物，其基因调控具有 复杂性，致死性状的产生极有可能是由多基因调控的。利用半定量RT-PCR技术比较两种交配组合小鼠早期 胚胎细胞中候选基因表达情况的差异，证实了Om基因控制的卵子细胞质物质以某种机制作用于Mcl．1，Bcl-2， EGF，EGF．R基因，并通过这些基因表达水平的降低直接或间接地引发早期胚胎致死现象。 ～205—