PKCIW在鸡胚成纤维细胞和鸡胚中的异位(超)表达.pdfVIP

第十五次全国动物遗传育种学术讨论会论文集 PKCIW在鸡胚成纤维细胞及鸡胚中的异位(超)表达 龚萍，杨宇，杨永平，马骁，俸艳萍，彭秀丽，李世军，龚炎长 华中农业大学动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，武汉430070 关键词：鸡；性别决定；PKC州：异位(超)表达；电穿孔 引言 自Sinclair等首次从人类Y染色体上分离得到职y基因以来，人们对哺乳动物性别决定的研究已取得了 长足进展，而禽类性别决定的机制至今还不清楚。P愆ny作为禽类性别决定的一个重要候选基因，近年来得 到了广泛关注。PKCI属于组氨酸三联体蛋白家族，编码一种核酸水解酶，该酶以同源二聚体的形式发挥作用。 尸聊在鸡性分化前开始表达，表达仅限于雌胚泌尿生殖系统，随着卵巢的发育，尸xCn矿继续表达，但表达 水平降低。本文采用四环素诱导表达技术在鸡胚成纤维细胞及鸡胚中研究P^，c，w的生物学功能，为鸡性别决 定机制的研究提供线索。 材料方法 本实验分四个组，即雄性正常组、雄性异位表达组、雌性正常组和雌性超表达组，每组设3个重复。用 以确定纠聊在鸡胚性腺发育基因调控网络中的位置。 分析P脚异位(超)表达的效果；用电穿孔法(CUY21)分别转染孵化早期的雌、雄鸡胚，并探索早期鸡 胚体外培养的方法及卵内、卵外电穿孔的方法。 结果 在鸡胚成纤维细胞水平的RT-PCR结果表明，导入诱导表达载体能显著提高雌性鸡胚成纤维细胞中 P豳e，1^，的表达水平，雄性正常组中P配ny不表达，但导入诱导表达载体后P幻em，的表达水平接近雌性正常 的异位(超)表达后没有发生显著变化。 在孵化的鸡胚水平发现，早期鸡胚采用体外合成培养基培养法，孵化1．5d的鸡胚不同日龄后存活率均最 高，9日后仍有存活；采用体外双层培养皿培养法，孵化2．5d的鸡胚不同日龄后存活率均最高，最长可存活 至18．5日龄。卵内电穿孔可采用z形针胚胎铂电极，卵外电穿孔可根据鸡胚体外培养方法的不同而采用方形 培养皿铂电极和Z形针胚胎铂电极。 讨论与结论 禽类性别决定与性分化通路是一个多基因参与且相互作用的复杂调控过程，S11imada将控制性腺发育的基 因分为上游基冈和下游基因，雌性以芳香化酶基因(P45∞rom)为分界点，雄性以抗缪勒氏管激素基因(A肘日) 为分界点，其中芳香化酶足雌激素合成途径中的关键酶，而抗缪勒氏管激素是雄性性腺发育的信号。PKCIW 在雄性、雌性鸡胚成纤维细胞中的异位(超)表达引起了Ⅳ5D口rDm的上调表达和AMH的下调表达，表明肷C删 可通过调控P‘≠5∞rDm和AMHmRNA水平的表达，从而在鸡性别决定及性分化过程中起作用。 鸡胚卵内、卵外电穿孔各有其优缺点，但在研究早期鸡胚发育过程时，卵外电穿孔更有优势。本文所建 立的早期鸡胚体外培养技术一体外合成培养基法和体外双层培养皿法，操作简单，成本低，可满足对早期发育 的鸡胚进行卵外电穿孔的需要，同时也更便于观察。目前正在进行诱导表达载体的卵外电穿孔研究，将进一 步采用RQ—PCR、WISH及免疫荧光技术验证细胞水平的分析结果。 致谢 (20070504040)资助。 一212—