PCR扩增Nuc基因检测奶牛乳腺炎致病性金黄色葡萄球菌.pdfVIP

维普资讯 第 28卷第 6期 家畜生态学报 Vo1．28No．6 2007年 11月 ActaEcologiaeAnimalisDomastici Nov．2007 PCR扩增 Nuc基因检测奶牛乳腺炎 致病性金黄色葡萄球菌 杨宏军 ，高运 东 ，王长法 ，杨少华 ，仲跻峰 ¨，赵宏坤 (1．山东省农业科学院奶牛研究中心．山东 济南 250000；2．山东农业大学动物科技学院，山东 泰安 271018) [摘 要] 为建立奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌致病菌株的检测方法，依据金黄色葡萄球菌耐 热核酸酶Nuc基 因序列，设计合成特异性引物，通过聚合酶链式反应扩增 Nuc基因，并将扩增 基 因克隆入 T载体 ，进行序列测定，对所分离的奶牛乳腺炎病原菌进行鉴定。结果显示：金黄 色葡萄球菌扩增 出特异性务带，大小为 694bp；其他菌株未出现条带。敏感性检测的最低浓度 为 1．25×103cfu／mL。本试验所建立的方法具有特异性强、敏感度 高的特点。 [关键词] 金黄色葡萄球菌；奶牛乳腺炎；耐热核酸酶 [中图分类号] 8811．5 [文献标识码] A [文章编号] 1004—5228(2007)06—0080—03 目前兽医临床对金黄色葡萄球菌的鉴定是进行 1886)购 自中国兽医微生物菌种保藏管理中心。 细菌分离和生化发酵试验 ，时间长 ，错误率高。耐热 1．2 试剂 核酸酶 (ThermostableNuclease，TNase)是金黄色 高盐甘露醇琼脂、营养琼脂 (杭州天和)、Tris(上 葡萄球菌产生的一种细胞外酶，由致病性菌株产生， 海 生 工 )、 Agarose、Tryptone 、Yeast Extract 100℃作用 15min不失去活性，它的基因已经全部 (OxOID)、溶菌酶 (上海伯奥生物工程公司)、蛋 白 定序。金黄色葡萄球菌感染部位的组织细胞和白细 酶 K(Merck)、Ampline(北京鼎 国生物技术公司)、 胞崩解时释放出核酸，使渗出液粘性增加 ，而此酶能 pMDI8--T载体、BamH工和HandⅢ(TACARA)，其 迅速分解核酸，利于病原菌的扩散 ，因此将该酶的检 他试剂国产分析纯。 测作为鉴定金葡菌致病性菌株的重要指标之一。目 前 国内兽医临床尚无耐热核酸酶法鉴定奶牛乳腺炎 2 试验方法 金黄色葡萄球菌的方法 ，本试验利用聚合酶链式反 2．1 引物设计 应扩增出金黄色葡萄球菌 Nuc基 因，克隆测序并进 根据公开发表的Nuc基因序列设计引物，并由 行同源性比较，建立了金黄色葡萄球菌性乳腺炎的 上海生工合成如下引物对 ：目的基因 694bp 快速诊断方法。 Nuc1：5 一 GCCGAATTCGTTATGACAGA 1 材 料 ATACT 一 3 Nuc2：5 一 CAAGTCGACCAGCGTTGTCT— 1．1 菌株和样品 金黄色葡萄球菌临床分离株JN43由本试验室鉴 TCGC 一 3 定保存。标准株金黄色葡萄球菌(Sta．aureusATC_~ 2．2 金黄色葡萄球菌模板提取 25923)和大肠杆菌(EcoliATCC