PTEN基因甲基化及其表达异常与胃癌的关系.pdfVIP

维普资讯 维普资讯 · l384· 中国肿瘤 临床 2007年第34卷第24期 1 材料与方法 CGGGAAA’I’CG’I’GCG’I’GACAI’IIAAGGAGA-3．Anti- 1．1 研究对象 sense5-CGTCATACTCCTGCTrGCTGATCCACATCT 收集武汉大学人 民医院及武汉地区其它医院新 GC一3，扩增片断长度为479bp。扩增条件为 ：94℃ 鲜 胃癌手术标本 56例(每例分别取癌组织及癌旁正 3min，94℃ 30s，54℃ 30s，72℃ 45s，共 33个循环 ． 常组织)，经病理组织学检查证实，其中低分化 28 72℃7min。逆转录和PCR均设阴性对照，含所需全 例，中分化 11例，高分化 l7例 ；发生淋 巴结转移 29 部成分 ，但不加模板 。取 51xl产物加 1Ixl溴酚蓝 ，2％ 例 、无淋 巴结转移27例 (表 1)。切取组织标本离体 琼脂糖凝胶 电泳分析。 后立即置液氮 ，然后放入一7O℃低温冰箱中保存 。 1．3 统计学方法 1．2 方法 实验结果采用SPSS11．5统计软件进行 x检验。 1．2．1 DNA提取和亚硫酸氢钠修饰 采用蛋 白酶 2 结果 K一苯酚抽提法提总 DNA。紫外分光光度计检测总 2．1 PTEN基因甲基化分布情况 DNA含量和纯度 (A260／A2801．8)，琼脂糖凝胶 电 从表 1可见 ．胃癌组织中PTEN基因启动子区 泳检测 DNA完整性。稀释 21xgDNA于 501xl水 中， 5CpG岛甲基化的发生率显著高于癌旁正常组织 加入 3mol／LNaOH使其终浓度为 0．2mol／L，42℃变 (x=29．082，P0．01)(图 1)。 胃癌组织 中异常 甲基 性 30min。加入新鲜配置 的520~1亚硫酸氢钠和 化与其分化程度和淋 巴结转移有关 (x=8．666，P 301xl氢醌及石蜡油覆盖混匀 ，用铝箔包裹离心管避 O．05；x：7．212，P0．01)。 光 ，55℃水浴 16h。用 DNA纯化试剂盒纯化 (按说 明 表 1 胃癌及癌旁正常组织 中PTEN基 因 书步骤)后将 DNA重悬于 501xl水 中，再加入 NaOH mRNA表达及其甲基化情况 例 (％) (终浓度 0．3mol／L)37℃水浴 15min，然后用 NaAc、 无水 乙醇沉淀 回收 DNA，于燥 ，并重悬于 501xl水 中，一2O℃用箔包裹保存。未甲基化对照采用正常人 癌旁正常组织 56 2(3．6) 45(8O．4) 外周血淋巴细胞抽提的DNA进行亚硫酸氢盐处理。 胃癌组织 56 27(48．2) 0．000 26(46．4) 0．000 而将正常人外周血淋巴细胞经 SssI甲基化酶处理 性别 ． 0．830 0．327 后再经亚硫酸氢盐修饰作为甲基化对照。阴性对照 男 34 16(47．,1) 14(41_2) 用水代替模板 DNA进行 PCR。 女 22 11(50．0) 12(54．5)