ribR基因在产核黄素枯草芽胞杆菌中的组成型表达.pdfVIP

维普资讯 第 4O卷 第 6期 南 开 大 学 学 报 (自然科学版) Vo1．40 NO_6 2007年 12月 ActaScientiarumNaturaliumUniversitatisNankaiensis Dec．2007 文章编号：0465—7942(2007)06—0071—06 ribR基因在产核黄素枯草芽胞杆菌 中的组成型表达 宋 辉，班 睿 (天津大学 生物化学工程系，天津 300072) 摘要：枯草芽胞杆菌ribR基因编码单功能黄素激酶，催化核黄素转化为FMN．ribR基因作为 ytmI—ytnM 操纵子的一部分，其表达调控机制 尚不清楚．用PCR方法扩增了枯草芽胞杆菌veg基因的启动子 vegP，连接到 大肠杆菌一枯草杆菌穿梭载体 pHP13上，构建了表达型重组质粒 pHP13一V．用PCR方法扩增了ribR基因，连 接到pHP13一V上，构建了重组质粒 pHP13-VR．将 pHP13一VR转化产核黄素的枯草芽胞杆菌 24A1，使 ribR基 因在 24A1中组成型表达，得到菌株 24A1／pHP13一VR．与 24A1相 比，24A1／pHP13-VR菌落 由亮黄色变为微黄 色，核黄素产量下降为 1．26mg／mL，下降了45 ．结果说明，在nbC基因突变背景的过量合成核黄素枯草芽胞 杆菌中，ribR基因的存在对菌株的核黄素发酵有一定的抑制作用． 关键词：ribR基因；FMN；24A1／pHP13一VR；枯草芽胞杆菌 中图分类号：Q786 文献标识码 ：A 核黄素是一种重要的B族维生素，在细胞 内以黄素单核苷酸 (FMN)和黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)的 形式 ，作为多种氧化还原酶的辅酶 ，参与细胞的生物氧化还原反应．核黄素主要通过微生物发酵进行工业 化生产 ，其 中重组枯草芽孢杆菌 (B．subtilis)是 比较有优势的核黄素生产菌株．B．subtilis核黄素生物合 成途径中所有酶的编码基 因构成核黄素操纵子 (riboperon)．FMN是调控 6操纵子转录和翻译调控的效 应物 。 其作用于rib操纵子mRNA 的5端非翻译区内的RFN元件，使mRNA前导区形成特殊的二级 结构，从而抑制转录的继续进行和翻译的起始 ，这种基因表达的调控方式被称为 riboswitch机制． B．subtilis的ribC基 因产物是黄素激酶 ／FAD合成酶双功能蛋 白[4]，催化核黄素转化为 FMN及 FAD．某些nbC基因突变型的黄素激酶 ／FAD合成酶活性大幅降低 ，使 FMN 的合成量减少，进而解除了 FMN对rib操纵子表达的抑制，导致核黄素过量合成．或者 rib操纵子的调控区(ribO)发生突变，破坏 了 mRNA 的5一非翻译区内的RFN元件，使 rib操纵子的转录和翻译不受FMN抑制，从而导致核黄素过量 合成．因此，能够过量合成核黄素的B．subtilis生产菌株都是在 ribC突变，或者 ribO突变基础上进一步遗 传改造的重组菌． B．subtilis的ribR基 因编码单功能的黄素激酶[5]，可催化核黄素转化为 FMN．ribR基 因是 ytmI—yt- nM操纵子的一部分，其表达受 yrzC基因的负调控 ，具体机制尚不完全清楚[6卅]．ribR基因编码的单功能 黄素激酶在 pH8．5和 52℃下具有最大活性 ]，酶的活性需要 ATP和 Mg抖．因为尚不清楚 ribR基因在 细胞生长过程中的表达规律 ，所以ribR基因的存在是否影响胞 内FMN水平，进而影响核黄素的发酵，在 发酵过程 中难于观察和判断． B．subtilis24A1是一株在ribC基因突变遗传背景下构建的核黄素生产菌株[g]．通过PCR扩增ribR基 因，构建重组质粒，在B．subtilis24Al中组成型表达ribR基因，观察和讨论了HbR基因的表达对细胞核黄 素合成的影响． 收稿 日期 ：2006一10—15 基金项 目：功能基 因组学与精细化学 品制备过程代谢工程基础研究 作者简介 ：宋 辉 (1981一)，女，河北承德人 ，硕士