高质量分离乳猪肝细胞与短期培养观察.pdfVIP

均保持较强的合成尿素能力，但15％DMSO组较其它组有显著性差异，P0．05，见图3略。 讨论 目前超低温保存是长期储存肝细胞并建立肝细胞库的主要方法。但是影响肝细胞保存的因素诸多， 如冻存前肝细胞的存活率与能量状态、细胞密度、降温与复温速率、冻存液组分、血清浓度、冻存保护 剂(cryoprotective 的选择对肝细胞冻存的效果影响较大，它主要分为渗透性和非渗透性两类，肝细胞的长期冻存主要采用 渗透性保护剂，最常用的是DMSO。常用浓度在10％～20％之间，但最适浓度各家报道不一，而且不同 种属肝细胞的最适浓度也有一定的差别，如冻存鼠肝细胞最适DMSO浓度是16％，人肝细胞为10％． 12％等，猪肝细胞尚无相关研究报道。 温，置于一80℃条件下长期保存乳猪肝细胞，需要时快速复苏。结果发现5％DMSO组肝细胞复苏后的 乳猪肝细胞的活力并未随之上升，反而稍有下降，说明冻存肝细胞时，高浓度DMSO引起的高渗透压对 细胞有损害作用，冻存效果并非与DMSO浓度呈正比。另外，在以同样浓度DMSO的低温保存液保存 30d和60d的肝细胞中，复苏后细胞的存活率及贴壁率无显著性差别，这也说明冻存时间对肝细胞活力 无明显影响。从实验结果可看出，15％DMSO组冻存2月再复苏后接种培养肝细胞的生长情况、细胞结 构、药物代谢以及白蛋白的分泌等方面与未冻存肝细胞无显著性差别，15％DMSO组长期冻存肝细胞的 因，可能与较好维持细胞膜内外渗透压平衡，减轻细胞水肿有关，从而提高了冻存细胞复苏后的活力。 大量研究结果证实，经过超低温保存，肝细胞的活力都会有一定程度的下降，但是如能处理好上述 因素，优化肝细胞的冻存技术，可减少对肝细胞的损伤，建立肝细胞库，随时提供高活性肝细胞。从而 促进肝细胞在临床和基础研究方面的应用。 A28．高质量分离乳猪肝细胞和短期培养观察 浙江大学医学院附属第一医院310003 李兰娟李君曹红翠杨芊刘小丽陈智俞云松陈亚岗 盛吉芳 ＼。’、，‘／l ＼ 的分离技术得到了长足发展。应用分离肝细胞构建生物人工肝支技系统和进行细胞移植，来替代急、慢 1．1．1动物 断奶乳猪15只，月龄1．5个月左右，雌雄不限，体重6—10kg，购自本地专业养殖场。 1．1 2主要实验试剂和仪器设备 IV、WallianB Cotlagenase E、hepatzZYME—SFM、hepatocyte 瓶、培养板为Nunc公司产品；Olympus倒置相差显微镜(带摄影)、日本HITACHIH一600A透射电镜、 温离心机、蠕动泵、80目、150目不锈钢网筛，体外灌流装置自行设计。 1．2方法 一134— 1．2．1肝细胞分离 (15U／kg)，常规消毒皮肤，在严格无菌操作下，开腹、暴露门静脉、上腔静脉并结扎之，分离肝脏移至 可循环重复使用。至肝包膜与实质分离，整肝疏松，表面呈龟背状，停止胶原酶液灌流，用4。C Williams’E 液，40C、1209、5min离心3次，收集肝细胞。 1．2．2细胞培养 将新鲜分离肝细胞以1×105／ml接种于含HepatoZYME的培养瓶中培养24h。168h。 1．2．3细胞计数、活率、功能测定及形态学观察 用o．4％台盼兰拒染法观察新鲜分离肝细胞的活率，在普通显微镜下，用血细胞计数板计分离肝细 胞得率；在倒置相差显微镜下观察新鲜分离、经4。C保存24h以及培养24h后的肝细胞形态和结构；对 柠檬酸铅染色，HITACHI 72h、96h、120h、168h培养后上清液中“r、AST、LDH、ALB等含量。 1．2．4统计学处理 以t检验处理。 2结果 2．1经自行设计的体外灌流系统对乳猪肝脏行胶原酶两步灌流，新鲜分离的肝细胞经台盼兰染色 污染率为08(±0．3)％。 2．2相差显微镜下新鲜分离的肝细胞表现为透亮、呈球形且边界清晰，多数呈单个均匀散在分布， 而破损的肝细胞表现为细胞肿胀、出现空泡、胞膜缺损；培养24h后肝细胞已均匀贴壁，形态扁平、呈 多边形、通常多个细胞成串簇状排列。 2．3在透射电子显微镜下新鲜分离的单个细胞悬液失去了其典型的多边形结构，而呈球形。在细 胞膜水平，典型的毛细胆管和窦间隙极性变