肝移植患者人类白细胞抗原、抗体和CMV相关研究.pdfVIP

肝移植患者人类白细胞抗原、抗体及CMV柞I关研究 浙江大学医学院附属第一医院传染病诊治国家重点实验室(310003) 范骏张旋陈晓明高海女杨美芳赵宏马伟杭 自从肝移植作为治疗终末期肝病的方法被普遍接受后，许多研究开始致力于探索HLA与HLA抗体 系统在肝移植患者中的作用。以前，肝移植供受体术前HLA的检测不是必须的【l】，因为与肾脏及心脏 相比，肝脏不易发生超急性或其它体液排异。然而，到了现在，HLA相合度在肝移植受者长期存活中 起到的作用仍不清楚，仍是十分有争议的问题。 HLA抗体初次报道是在上世纪60年代，被认为跟移植后超急性排异反应的发生有关。在随后的数 年间，又有报道认为HLA抗体的表达与排异反应无关。现在关于HLA抗体的研究仍在进行，但是对它 在排异反应中的作用人们始终无法达成共识。 巨细胞病毒(CMV)是实质器官移植受者术后导致死亡的常见原因。至今，许多报道证实基因 突变与HLA基因型跟术后CMV感染有关。所以在此次研究中，我们第一次观察了供受体HLA相合度 与CMV感染的关系 总之，我们观察了中国肝移植受者中HLA相合度，HLA抗体与CMV感染情况。另外，我们观 察了急性排异的发生，确定供受体HLA相合度与CMV感染的关系，HLA抗原、抗体与急性排异的关 系，确定HLA相合的受益人群。 患者及方法 1．研究对象 究。所有患者移植后随访时间达6．30个月。供受体的HLA检测于术前进行。检测Ⅲ。A抗体和CMV感染 的血标本在术后收集时间如下：第一个月，第三个月，每半年一次直到随访结束。 2．HLA检测 lambda公司。原理是根据等 采用ssp—PCR方法(序列特异性引物多聚酶链反应)，试剂购自美国One 位基因核苷酸序列设计特异性引物，主要是针对第二外显子区域的多态性，用SSP mini kit,根据onelambda公司提供的 扩增出来的产物具等位基因特异性。DNA提取是采用QIAGEN PCR扩增程序扩增。取PCR扩增的产物与上样缓冲液混合，加入2％琼脂糖凝胶加样孔中，其内加入 溴化乙锭，在电压150V凝胶条件下电泳3-4min，然后在紫外灯下照相分析结果。 3．m．A抗体的检测 LAT 1240型试剂盒购自美国One 1： 10ull：3稀释的受者血清或阳性对照血清，室温孵育1h，缓冲液洗掉2次。再在每孑L加入10／A 100的酶联抗人抗体，加盖后室温孵育40min，然后每孑L加入10ul底物，37℃孵育10-15min，最后 每孑L加入5ul终止液，应用BIOTEK酶标仪(ELX800NB型)在630Bin波长下读版，I_ambda专用软件分 析打印结果。 ·193· 致敏程度的判断：PRA(％)=(阳性反应数÷40)X100％。PRA10％为阴性，受者未致敏；10％～ 40％为轻度致敏；40％～80％为中度致敏；≥80％为高度致敏。 4．CMV感染的检测 标准的两步法免疫组化检测外周血中CMV抗原的表达。从乙二酸四乙胺处理过的血标本分离出 白细胞，然后涂于玻片上。抗CMV pp65抗原单克隆抗体(DAKO，丹麦)和…．过氧化物酶试剂盒用 于CMV抗原在玻片上的染色。染过色的玻片在光学显微镜(BH．2．奥林巴斯，日本)下应用图像记录 系统分析。染成黄色或棕色的细胞为阳性，蓝色细胞为阴性。结果以每50000个白细胞中阳性细胞数 量计算。 5．急性排异的诊断 不管有没有组织学依据，谷丙转氨酶和谷草转氨酶或谷氨酰转肽增高酶，或三者同时升高，即可 转肽酶(正常范围9．54ILML)增高的定义为大于正常范围上限的3倍，或比先前的结果高50％。另外， 组织学诊断及急性排异的分级依照Demet