H7亚型禽流感病毒HA基因真核表达.pdfVIP

H7亚型禽流感病毒HA基因的真核表达 唐懿，庞平，武山，雷霆，陈福勇 (中国农业大学动物医学院北京100094) [摘 要]本研究的目的是克隆并表达H7亚型禽流感病毒的HA基因。为今后禽流感病毒蛋白的功能研究奠定了基 础，对禽流感病毒致病机制的深入研究有重要的参考价值。 18一T vector， 本研究利用PCR技术扩增H7亚型禽流感病毒的HA基因，并将PCR产物连接到克隆载体pMDSimple 色荧光，证明其得到了表达。 [关键词]禽流感病毒,HA基因l基因克隆l真核表达，绿色荧光 Influenza，AI)是由A型流感病 禽流感(Avian 购于北京百奥康生物技术有限公司)dNTP购于三 毒引起的禽类急性高度接触性传染病，严重威胁世 博远志公司；GoldviewTMDNA染料(溴化乙锭的替 界各地的养禽业，常常造成巨大的经济损失[2】。尤 代品)购于北京赛百盛基因技术有限公司；琼脂糖购 于北京百奥康生物技术有限公司。 其是H5、H7亚型引起的高致病力禽流感(hightly avian influenza，HPAI)是养禽业的一 pathogenic 种灾难性疾病[3]，国际兽疫局将其规定为A类传染2方法 病之一，我国也将此病列为一类传染病。 2．1引物的设计根据GenBank已发表毒株的基 Premier 禽流感病毒的基因组核酸在病毒增殖中很容易 因序列，用Primer 5．0软件设计了含Hind I和BamH 发生重排，有广泛的抗原漂移和抗原转变现象。其中 I酶切位点的一对特异性引物。 ACCATGAAC CTTGCC 以血凝素(Hemagglutinin，HA)基因的变异率最上游引物：5’一AAG 高。禽流感病毒的抗原性和致病性在很大程度上取 ACTCAAATCCTGATACTCG一3’ 决于血凝素基因，所以HA基因是研究学者较为关 (含有HindI酶切位点) ATCCGATATACAAAT 注的基因。 下游引物：5’一GG GGTGCACCGCATGT一3’ 本研究构建了重组表达载体pEGFP—HA，在 BHK细胞中进行表达，为对研究禽流感病毒血凝素 (含有BamHI酶切位点) 蛋白功能的后期工作打下了坚实的基础。 PCR引物由上海申能博彩公司合成。 2．2目的片段的扩增用阳性质粒作为模板，PCR l材料 lmin；72℃lmin20seeI30个循环；终延伸72℃ 1．1阳性质粒pMDl8--Q7，本实验室保存。 10min。在1％琼脂糖凝胶中电泳，分离扩增产物。 1．2菌种和质粒Topl0，购于天为时代科技有限 18一T vector，为克隆载体，购于2．3重组克隆质粒的构建用琼脂糖凝胶DNA回 公司；pMD Simple TaKaRa公司IpEGFP--N1真核表达载体，本实验收试剂盒回收扩增的基因产物，按照pMDl8