应用基因芯片鉴别猪流感病毒亚型方法建立和初步应用.pdfVIP

猪的传染病 3．1本试验初步建立了猪流感间接ELIsA，优化了猪流感间接ELIsA工作条件，并进行 了特异性和重复性试验。结果表明，本方法具备良好的特异性和重复性，可用于猪流感的血 清学诊断。 3．2本试验研究了采用不同亚型的流感病毒做为包被抗原，进行ELISA测定。试验中采 用的全病毒包被，用作免疫原进行免疫时，得到的阳性血清为多克隆抗体，因此不具备型特 异性。实际结果也说明该方法不具备型特异性。如果采用原核或真核表达载体制各重组SIV 核蛋白(NP)作为包被原进行ELISA，能使其具备区分猪流感病毒各亚型抗体的能力，同 时具备相当高的灵敏度和特异性，该方法具有显著的优点值得进一步的探讨研究。 3．3本试验对不同的省采集到的血清样品进行了检测，结果说明受调查的地区都曾感染 过猪流感，说明猪流感的流行在当前已相当普遍。 参考文献略 应用基因芯片鉴别猪流感病毒亚型方法的建立和初步应用 昊时友1陈虹军2尹燕博‘钱永华2 (1山东澳兰生物工程研究院青岛山东2661们2西北农林科技尢学杨凌陕西712100；) 擅要根据Gcnb卸I泼表的械酸序列，运用D1怕MAN软件，分析流感霸毒的HA和NA基因序列间的差异 性．分别设计合成流感病毒Hl、m，H9、Nl和N2的特异分型引物．并根据A型流感病毒的型特异性基因(M 基因)，设计了A型流感病毒的通用引物．应用RT．PcR分别扩增各亚型的特异片断，井克隆到pMDl8-T simplcv∞cor构建重组质拉，用于各亚型探针的制备．特备撂针按一定的阵列点加到硝酸纤维素膜上-制 备成低密度基因甚片．在多重PcR过程中，用生物素标记的dulP(B珏ll-dUl_P)对待检样品进行标记，扩增 产物与基因芯片杂交，最后用扫描仪进行读片和分析．对临床疑似病例检测结果表明．谊方法可以同时检 测持检样品中病毒5种亚型5个基因厦A型流感病毒的存在情况，与PcR方法相比。显示了较高的灵教度和特 异·|生．谊方法的建立．为批量样品的检测和猪流感病毒各亚型在猪群中的流行病学调壹提供了一种快连， 灵教和高通量的手段． 关键词猪流感病毒；基因芯片；多重PcR；核酸杂交 猪流感(swine Innuen∞，SD是由正黏病毒科猪流感病毒(sIv)引起的一种急性高度接触 传染性的群发性猪呼吸道疾病，临床以突发、高热、咳嗽、呼吸困难、衰竭、高发病率、低 和H5N18种不同血清亚型，流行于猪群中的主要有古典型猪H1Nl、类禽型HlNl和类人型 H3N2毒株闭。我国的SI近年有蔓延抬头的趋势，HlNl和H3N2亚型猪流感在我国大范围流彳亍， 此外，H5N1和H9N2在我国猪群中已经被分离到。猪的种间屏障相对较低，在“禽．猪-人”的 种间传播链中，扮演着流感病毒中间宿主及多重宿主的作用。是人流感病毒和禽流感病毒 (AIv)双重感染的“混合器”I“，已有人感染SIV及少数死亡的报道。对sI的监测可以为动物流 感及人流感的疾病预测及防制提供重要依据和理论指导。为此，本研究运用近几年新发展起 来的基因芯片技术，借助多重PCR、核酸杂交以及核酸标记技术等。建立了能同时检测A型 流感病毒并分辨出HA基因的H1、H3、H9和NA基因的Nl、N2亚型的基因芯片检测方法。 l材料与方法 1．1材料 1．1．1病毒 青岛易郭生物工程有限公司。 1．1．2猪棉拭子和病料 农业部948课题项目(项日箱号：2004．z40)资助 400 中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十二次学术研讨会 分别采自青岛、烟台、潍坊、南昌、葫芦岛、连云港等市健康猪群或病死猪，置．75℃ 保存备用． 1．13受体菌 E∞，f】M109由山东澳兰生物工程研究院保存。 1．1．4主要试剂 PcR试剂、RN鹊e 18-T Vector、T‘DNA Illllibitor、pMDSimple lig丛e、FrG、X-ga嘲 自大连宝生物：M-MLV DNA reve雠transcriptase为Promega公司产品irecaverkit购自v．gene 生物技术有限公司i鲑鱼精子DNA为si鄹№公司产品。 1．2方法 1．2．1引物设计 根据Genbank发表的核