应用外显子扩增和拼接法克隆鸡卵清白蛋白基因(OVA).pdfVIP

细胞工程与转基因 应用外显子扩增和拼接法克隆鸡卵清白蛋白基因(0VA) 张婷婷，王瑞，张智英 西北农林科技大学动物科技学院，陕两杨凌712100 关键词：外显子扩增和拼接； OVA；重叠PCR 引言 基因的克隆和表达是研究一个基因功能的基础。传统基因克隆方法是利用RT-PCR扩增全长基因。该方 法涉及RNA的分离和纯化、反转录反应以及PCR扩增。该方法在克隆高表达基因方面得到成功应用。然而， 对于那些些低表达基因或者组织特异表达以及受时空调控表达的基因，传统基因克隆方法的应用受到限制， 同时加上RNase酶的影响，增加了这些基因成功克隆的难度。随着各类动物基因组测序工作的完成，为应用 外显子扩增和拼接法克隆摹因提供了条件。本研究对原有外显子扩增和拼接法进行了改进，通过将引物设计 在相邻外显子连接处，使引物重叠区处于外显子内，即可通过一步重叠PCR克隆获得全长目的基因。应用改 进的外显子扩增和拼接法成功从鸡基因组中克隆了鸡卵清白蛋白 基因(OVA)。 材料方法 取新鲜莱航公鸡肝组织样，采用酚仿抽提法提取基因组DNA，根据GENBANK公布的OVA基囚序列， 设计7对上下游引物，其中相邻外显子间的上游引物和下游引物各有20 bp的重叠。采用降落式PCR对7个 外显子进行扩增，分别进行胶回收纯化，鉴于第三外显子只有68bp，先将2、3外显子进行拼接，同时将4、 全长目的片段。 结果 鸡OVA基因全长为7，573 bp，含有8个外显子，ATG密码子位于第2外显子内，在引物PCR扩增外 显子引物设计时，第2个外显子扩增引物是从ATG开始，包含下游17个碱基，引物的5‘端含有克隆酶切位 点，反向引物包含第3外显子3’端的20个碱基，其引物的5‘端含有第4个外显子5’端的10个碱基(外显子 重叠序列)；第4外显子PCR扩增引物的设计为，正向引物含有第4外显子‘端的20个碱基，引物的5’端含 有第3外显子3‘端的10个碱基(外显子重叠序列)，反向引物含有第4外显子3’端的20个碱基，引物的5‘端 含有第5外显子5’端的10个碱基(外显子重叠序列)；其他外显子引物的设计与第4外显子引物的设计相同。 第8外显子的反向引物的5‘端含有克隆位点。首先利用降落式PCR方法从基因组中分别扩增7个外显子，利 用胶回收试剂盒回收各个外显子。由于第3外显子只有68 bp，为了保证拼接成功，我们先将第2-3外显子、 第4-8外显子进行PCR拼接，分别得到了248 bp和962bp的片段，再将这两个片段连接，获得CDS区全长 序列，PCR产物克隆到真核表达载体。测序结果显示，克隆产物与Genbank公布序列比对相似度高达99％。 讨论与结论 本实验结果证明，应用改进后的外显子扩增和拼接法能够快速有效的从基因组中获得CDS区全长序列。 在相邻外显子拼接处设计重叠引物，可以利用重叠PCR方法一步扩增得到全长目的基因。避免了以往外显子 拼接克隆时引物和时间的消耗。在实验中由于第3外显子仅有68bp，利用胶回收试剂盒回收效率不高，采用 酚仿抽提法进行回收，可大大提高回收效率；将第2、3外显子和第4。8外显子先分别进行连接，然后在进行 全长基因的连接，这样可以增加外显子拼接的效率。 ～237—