第四章 生物学与分子生物学技术实践.doc

第四章 生物学与分子生物学技术实践 DNA的粗提取与鉴定（补充） 【课标要求】理解DNA粗提取与鉴定的实验目的、原理、方法和操作步骤 【学习目标】 1．通过尝试对植物或动物组织中的DNA进行粗提取，了解DNA的物理化学性质。理解DNA粗提取与鉴定的原理。 2．掌握DNA如提取技术，能利用DNA的性质进行实验设计和操作。 3．通过对DNA的粗提取的实验过程的设计及操作，锻炼科学的思维方法，培养实事求是的科学态度。 【学习过程】 无论是果胶酶还是加酶洗衣粉中的酶制剂，都是从细胞中提取出来的。从今天开始，我们学习生物化学成分的提取与改造技术。 一．DNA粗提取的方法 1．概念：要利用DNA与____________、蛋白质和____________等在物理和____________方面的差异，提取DNA，去除其他成分。 2．方法： （1）DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的__________ 溶液中溶解度不同。利用这一特点，选择适当的__________就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以到达分离的目的。 [读图分析]：DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度有何特点？要使DNA溶解，需要使用什么浓度？要使DNA析出，又需要使用什么浓度？ （2） DNA不溶于____________，但是细胞中的某些蛋白质则溶于此溶液。 [思考]：采用DNA不溶于酒精的原理，可以达到什么目的？ （3）____________能水解蛋白质，但对DNA没有影响。大多数蛋白质不能忍受____________的高温，而DNA在___________以上才会变性。洗涤剂能瓦解_________，但对DNA没有影响。 补充：DNA的变性是指DNA分子在高温下解螺旋，其温度在80℃以上，如在PCR技术中DNA变性温度在95℃。 [小结]：提取DNA的溶解性原理包括：DNA在 溶液中溶解度不同；DNA不溶于 。 二、DNA的鉴定：在____________的条件下，DNA遇二苯胺反应呈现____________。 三、实验设计 1．选取实验材料： 不同生物的组织中DNA含量不同，选用____________的生物组织，成功的可能性更大。备选材料：猪38条，鸡78条，哺乳动物血0条，猕猴桃58条，洋葱16条，豌豆14条，菠菜12条，大肠杆菌1条。 在选取材料时，应本着DNA含量高、材料易得、便于提取的原则。你认为教材提供的材料中哪些不适合提取DNA？请选择动植物材料各一种。 2．破碎细胞，获取含DNA的滤液： （1）若选用鸡血和洋葱作实验材料，则怎样获取含DNA的滤液？ 在鸡血细胞液中加入一定量蒸馏水并用玻棒搅拌，过滤后收集滤液；切碎洋葱，加入一定量洗涤剂和食盐，搅拌研磨，过滤后收集滤液。 （2）在以上实验中，加入蒸馏水、洗涤剂和食盐的作用分别是什么？ 血细胞在蒸馏水中大量吸水而张裂；洗涤剂瓦解细胞膜；食盐溶解DNA物质； （3）在处理植物组织时需要进行研磨，其目的是什么？研磨不充分产生什么结果？ 破碎细胞壁，使核物质容易溶解在NaCl溶液中；研磨不充分会使DNA的提取量减少。 具体做法。10mL鸡血＋20mL蒸馏水→同方向搅拌→3层尼龙布过滤→滤液 （4）过滤时应当选用（滤纸、尼龙布）。 3．去除滤液中的杂质： 最初获得的DNA滤液含有蛋白质、脂质等杂质，需要进一步提纯DNA。 （1）方案一：原理是DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同； 30mL滤液＋35gNaCl→同方向搅拌，DNA溶解→加入蒸馏水→DNA析出→过滤得到过滤物→放到2mol/LNaCl溶液中溶解→DNA-NaCl溶解液 （2）方案二：原理是蛋白酶分解蛋白质，不分解DNA； 30mL滤液＋嫩肉粉（木瓜蛋白酶）→静置10～15分钟→DNA滤液 （3）方案三：原理是蛋白质和DNA的变性温度不同。 30mL滤液→60～67℃处理→过滤获得DNA滤液 4．DNA的析出与鉴定： （1）析出：滤液与等体积的冷却酒精混合均匀，静置2～3分钟，析出的白色丝状物就是DNA。DNA呈白色。 （2）DNA的鉴定过程： 试管2支，编号甲乙→各加等量5mLNaCl溶液→甲中放入少量白色丝状物，使之溶解→各加4mL二苯胺，混合均匀→沸水浴5min→观察颜色变化 四、实验操作 制备鸡血细胞液…………加柠檬酸钠，静置或离心 ↓ 破碎细胞，释放DNA… 加蒸馏水，同一方向快速同方向搅拌 ↓→过滤，除去细胞壁、细胞膜等。 溶解核内DNA………… 加入NaCl至2mol/L，同一方向缓慢搅拌 ↓ DNA析出……………… 加蒸馏水至0.14mol/L，过滤，在溶解到2mol/L溶液中 ↓→除去细胞质中的大部分物质。 DNA初步纯化………… 与等体积95％冷却酒