多个发夹RNA的混合使用抑制O型和AsiaI型口蹄疫病毒的复制.pdfVIP

第47卷 第 5期 复 旦学 报 (自然科学版) Vo1．47No．5 2008年 10月 JournalofFudanUniversity(NaturalScience) Oct．2008 文章编号：0427—7104(2008)05—0545—08 多个发夹 RNA的混合使用抑制 。型和 AsiaI 型 口蹄疫病毒的复制 金 虹 ，丛 薇 ，刘明秋 ，严维耀 ，陈九连2，高艳华2，郑兆鑫 (1．复旦大学 生命科学学院遗传学研究所 遗传工程国家重点实验室，上海 200433； 2．金宇集团生物制药公司，内蒙古010021) 摘 要：通过对国内流行的口蹄疫病毒(F^D、，)毒株的序列分析，锁定RNA干扰的3个 目标基因即3D，VP4和 2B，分别编码聚合酶POL，病毒结构蛋白VP4和非结构蛋白2B，这 3个靶基因序列在不同流行毒株之间相对保 守．分别设计合成靶向这些基因序列的发夹RNA(short—hairpinRNA，s NA)表达模板 ，构建了5个shRNA表达 质粒p3D-NT56，p3D-NT19，pVP4一NT65，pVP4一NT19和p2B-NT25．进行单独应用或混合应用 ，于细胞水平和乳 鼠水平检测其抗病毒活性．结果显示，3D-NT56／19，VP4一NT65／19和2B—NT25shRNA对 0型FMDV均有抑制 作用，但是对AsiaI型FMDV，仅2B-NT25shRNA具有较显著的抑制作用．3个 shRNA表达质粒的混合使用 (p3D-NT56+pvP4一NT65十p2B-NT25，p3D-NT19+pVP4一NT19+p2B-NT25)，不仅能够交叉抑制不同血清型 FMDV的复制，而且这种抑制作用较单一 shRNA延续更长的时间． 关键词 ：121蹄疫病毒；RNA干扰；发夹 RNA (shRNA)；保守序列 ；交叉抑制 中图分类号 ：Q78 文献标识码：A RNA干扰 (RNAinterference，RNAi)是20世纪90年代末发现的一套转录后基因沉默机制，在真核生 物细胞内，由一种长度为 19--27bp的小干扰RNA分子(siRNA)诱导对与之具有序列同源性的基因转录 产物mRNA进行剪切降解或翻译阻断．现在，科学界已普遍达成共识 ，即在植物和昆虫中，RNAi是主要的 病毒防御机制…1；而且RNAi分子机制在哺乳动物中也是保守的，尽管存在争议，但是越来越多的证据表 明，RNAi在哺乳动物细胞抗病毒机制方面同样扮演着重要的角色l24j．如灵长类泡状病毒 1型(PFV一1)和 泡状 口腔炎病毒 (VsV)，能够分别被细胞 内的microRNA (microRNA-32和microRNA-24+microRNA一 93)抑制[5,6]．反过来病毒感染同样能够影响细胞 microRNA的表达模式 J．另有数据显示在 HIV一1复 制过程中，细胞内有大量病毒特异性的siRNA积聚l2J．这些研究结果说明RNAi作为抗病毒机制可能同 样在物种之间存在保守性．然而哺乳动物在进化过程中进化出了一套十分完善高级的蛋白质水平免疫系 统(protein—basedimmunesystem)，RNAi作为一种核酸水平免疫系统 (nucleicacid—basedimmunesystem)的 抗病毒功能似乎并没有像在植物和昆虫细胞中那么具有优势 8．因此，病毒学家们希望能够利用人工方 法在哺乳动物细胞中建立有效的RNAi抗病毒防御策略，以弥补传统的抗病毒疫苗或抑制剂的缺陷．迄今 为止，有大量的报道表明，通过人工转染 siRNA或双链 RNA (double—strandedRNA，dsRNA)能够有效地 诱发RNAi抵抗病毒感染 1 ． 口蹄疫(foot—and—mouthdisease，FMD)是发生在偶蹄类动物包括猪、牛、羊等家畜的高度传染性疾 病ll，被世界动物流行病组织定义为A类传染病之首．该病的爆发流行直接给国家造成巨大的经济损 失．LI蹄疫病毒 (foot—and—mouthdiseasevirus，FMDV)是FMD的致病原，属于小RNA病毒科(familyPicor— naviridae)=I1蹄疫病毒属(genusAphthoviurs)．像其他的