TLR4在肝癌细胞株HepG-2的表达.pdfVIP

维普资讯 沈阳医学院学报 JournalofShenyangMedicalCollege 第9卷 第4期 2007年 12月 TLR4在肝癌细胞株 HepG一2的表达 李牧，隋春阳 (沈阳医学院奉天医院普外科，辽宁 沈阳 110024) [关键词]TLR4；肝细胞癌；HepG一2 [中图分类号]R654．4 [文献标识码]A [文章编号] 1008—2344(2007)04—0210—02 T0u样受体 (toll-likereceptors，TLR)是炎症 r／min)，一70℃低温冰箱保存待检。 信号传递的门户蛋白，在免疫防御反应中起重要 1．2．2 Western-blot 取 1x10细胞加入1ml细胞 作用。TLR4(Tol1．1ikereceptors4，TLR4)是第一 裂解缓冲液 [100mmol／L s／Hcl(pH7．5)， 个发现的哺乳动物的Toll样受体，TLR4主要表达 lOOmmol／L氯化钠，0．5％脱氧胆酸钠，1mmol／L 在淋巴样组织 (如脾)和外周血白细胞如单核巨 已二胺 四乙酸 (EDTA)，1％NP40，0．1％十二烷 噬细胞、树突状细胞、小部分的表皮细胞系 以及 基硫酸钠 (SDS)和蛋 白酶抑制剂]，提取细胞的 T、B淋巴细胞系上 ¨。研究表明TLR4不仅表达 总蛋 白并经 Larry法定量，取 50~xg蛋 白上样到 在免疫系统相关的细胞中，在一些组织细胞 中也 15％的SDS-聚丙烯酰胺凝胶，电泳 (100V，1．5 有表达 ，特别是和外界环境相对接触较多的上皮 h)。待溴酚蓝进入凝胶底部后，把蛋 白质再印迹 细胞 ，如 胃、肠、肺 、牙龈、肾的上皮细胞 、肝 到硝酸纤维素膜上，用抗Livin抗体和抗B．actin抗 等 叫 ，研究者还发现许多来源不同组织的肿瘤 体孵育，最后加入用碱性磷酸酶 (AP)标记的相 细胞表面都表达TLR4，这可能与肿瘤的免疫微环 应二抗，用 O-Dianisidine，Tetrazotized和 B．Naph． 境的建立与维持有关 ～ 。如 胃癌 的细胞表面有 thylAcidPhosphate显色剂进行显色后用凝胶成像 TLR4的表达，而TLR4的表达使 胃癌细胞可以与 仪分析图像。 幽门螺杆菌相互作用而诱导产生促 胃癌细胞生长 1．2．3 RT-PCR 采用 Trizol试剂一步法提取组织 的因子 。研究显示TLR4在一些肝脏疾病如病毒 总RNA，紫外分光光度计测定纯度并定量。根据 型肝炎、肝硬化、肝纤维化、酒精性肝病等的发 GenBank提供的TLR4和 内参照 B．actin的mRNA 生及发展机制中亦有重要作用 。本实验利用RT- 序列，应用软件PrimerPremier5．0自行设计引物。 RCR和Westernblot方法从基因和蛋 白两个角度来 引物序列如表 1。 检测肝癌细胞株 HepG-2是否有 TLR4的表达，这 表 1 TLR4和 ~-aetin引物序列 将为今后对TLR4的研究奠定基础。 名称 引物序列 扩增片断 退火温度(℃) 1 实验材料与方法 1．1 实验材料 HepG-2细胞株 (中国医科大学 肿瘤研究所第一研究室)；兔抗人TLR4一抗 (博 士德生物技术有限公司)；鼠抗 B．actin