番茄斑萎病毒外壳蛋白原核表达及Dot-blotELISA检测方法的建立.pdfVIP

浙江大学学报(农业与生命科学版) 34(6)：597～601，2008 JournalofZhejiangUniversity(Agric．＆．LifeSci．) 文章编号 ：1008—9209(2008)06—0597—05 DOI：10．3785／jissn．1008—9209．2008．06．002 番茄斑萎病毒外壳蛋白原核表达及 Dot-blotELISA检测方法的建立 于 翠 ，邓凤林。，杨翠云 ，吴建祥 (1．上海出入境检验检疫局，上海 200135i2 浙江大学 农业与生物技术学院生物技术研究所，浙江 杭州 310029) 摘 要 ：将番茄斑萎病毒(Tomatospottedwiltvirus，TswV)全长外壳蛋 白基 因亚克隆到原核表达载 体 pET一32a中，经限制性酶切分析及测序结果表 明插入方向_fi-确且阅读框架无移码 突变．将重组表达 质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，SDS分析结果证实IPTG可诱导1个分子量约为 48kDa的融合 蛋 白表达 ．利用 6×His标签单抗和TswVFoPaTsl多抗证实所表达 的蛋 白为 TswV外壳蛋 白．以纯 化的重组外壳蛋 白免疫小鼠，制备杂交瘤细胞培养上清单抗，并用杂交瘤细胞培养液上清建立 了可靠、 有效检测 TSWV的 Dot—blotELlSA 方法． 关 键 词 ：番茄斑萎病毒 ；原核表达 ；Dot—blotELISA方法 中图分类号 ：Q78；$432．41 文献标识码 ：A YU Cui、DENG Feng—lin YANG Cui—yun ，WU Jian—xiang (1．ShanghaiEntry—ExitInspectionand QuarantineBureau，Shanghai200135，China；2．InstituteofBiotechnology，CollegeofAgriculture＆ Bo c村oZ0g ，ZhejiangUniversity，Hangzhou310029，China) Prokaryotieexpression offullcoatprotein geneofTomatospottedwiltvirusanddevelopmentofDot。blot ELISAmethodforthisvirusdetection．JournalofZhejiangUniversity(Agric． LifeSci．)，2008，34 (6)：597-6Ol Abstract：Thefullcoatprotein gene ofTomatospotted wiltvirus (TSWV ) was subcloned into a prokaryoticexpression vectorpET一32a．Resultsofrestriction enzyme digestion and DNA sequencing show thattheinsertiondirection and sequencewerecorrectandnoframeshiftmutationexisted．This recombinantprokaryoticexpressionvector (pET一32aTSWV—CP)wasusedtotransform E．coliBL2l (DE3)．SDSanalysisconfirmedthattherecombinantcoatprotein withthepredicted molecular weightofabout48kDawassuccessfullyexpressedinE．coliBL21 (DE3)strainwiththeinductionof IPTG in theform ofa fusion protein．Theexpressive coatprotein wasconfirmed by 6× His tag monoclonalantibodyandTSW V antiserum raisedagainstTSW V FoPaTs1．Thepurified recombinant coatprotein was used to immu