高氧影响肺泡Ⅱ型上皮细胞水通道蛋白-1表达和功能研究.pdfVIP

·大会报告· 全国第九届新生几学术会议 高氧影响肺泡II型上皮细胞水通道蛋白一1表达与功能研究 张秋月1’2富建华1薛辛东1 中国医科大学附属盛京医院儿科 AECII是肺内的干细胞，在肺的生长、发育及损伤后的修复中起着重要作用。肺泡上皮发生损伤后， 因AECI无再生能力，故需完全依赖AECII的增殖、分化方能完成肺上皮修复和重建，若延迟修复，可 影响上皮细胞对肺泡壁成纤维细胞的抑制作用，从而导致成纤维细胞增生，与肺纤维化发生关系密切[11。 因此，在肺损伤的研究中，对AECII的研究也就显得尤为重要。 近年来研究表明肺泡II型上皮细胞(AEcII)除分泌表面活性物质外，在肺内体液平衡调节中也起 着重要的作用f2一¨。AECII细胞膜上水钠通道及钠钾ATP酶的相继发现和证实，奠定了AECII在钠水转 运中的地位【3】，但在高氧状态下AECII液体主动转运的调节机制尚不十分清楚。 本研究将以原代培养的AECII为实验对象，利用实时荧光定量PCR及WesternBlot等分子生物学技 术来研究AQPl在高氧条件下的表达及功能变化，试图从肺水清除方面来进一步探索高氧肺损伤时肺水 肿的形成机制。 1材料和方法 1．1 AECII的分离培养和鉴定 参照DOBBS掣别的方法，将生后24h内新生大鼠用10％水合氯醛麻醉后无菌取肺组织。用预冷的 杉金桥)免疫粘附法纯化细胞。用免疫荧光技术及透射电镜鉴定细胞，用台盼兰染色测细胞活力。 1．2分组及方法 细胞贴壁后换液，随机将其分为实验组和对照组。分别置于高氧细胞培养箱(氧体积分数=0．9)和 普通细胞培养箱(氧体积分数=0．21)中培养并于24h、48h、72h收集细胞于一80℃保存，待检测。 1．3AECIIAQPImRNA实时荧光定量PCR测定 取冻存样本提取总RNA，逆转录合成cDNA，PCR扩增引物设计按照GenBank大鼠AQPlcDNA序列， 用PrimerPremier5．0引物设计软件，由三博远志有限公司合成。AQPl引物序列上游：5‘ ACCCGCAACl]rCTCAAAC3’下游5’CAGGTCATACTCCTCCACTr 3’。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶 2出△c1方法分析数据，得到不同样本qbAQPl基因相对表达情况。 1．4Western II Blot法检测AEC AQPI的表达 取冻存的细胞样本，提取蛋白，进行蛋白定量，用SDS．PAGE凝胶电泳并将其转印至纤维素膜上， 孵育40mill，然后ECL发光。将胶片于成像系统中拍照，保存图片。结果用相对灰度值表示，相对灰度 =目的条带灰度／对应内参条带灰度。相对灰度值越高表示蛋白含量越高 238 全国第九届新生儿学术台议 大会报告 1 5细胞体积检测 悬渡0 (FSC)的平均强度”I。细胞从流式细胞仪喷嘴成单行喷出时，受到激光的照射会发生对光的散射。其中 FSC的强度主要与细胞的体积成正比，印细胞体积越大，散射光也越强。因此细胞体积我们以Fsc的平均 强度的道数来表示。 1 6统计学处理 应用SPSSl30软件进行统计分析。计量蛰料采用均数±标准差(J±5)表示。采用两因素方差分析 2结果 2 1AECII的整定 透射电镜下可见AECII内的特征性结构板层小体，其呈同心圆状或平行排列的板层结构，还a，见到 线粒体、内质网、高尔基体等细胞器，细胞游离面可以见到微绒毛。(圈1) 5±3 定位在胞浆，AECII呈阳性表达。(图2)细胞纯度达(9228)％，台盼蓝拒染实验测细胞活力为 f95：i：1061％。 图1透射电镜下观察AECll 图2 AECII的免疫荧光鉴定(×400) 2 2高氧暴露AECnAQPImRNA的动态表达 (见图3．图4) 大会报告