副猪嗜血杆菌SC-1株的分离培养和其基因组表达文库的初步构建.pdfVIP

第三篇疾病防治 副猪嗜血杆菌SC一1株的分离培养及其 基因组表达文库的初步构建术 都启晶 曹三杰 庞 倩 王国镔 黄小波 文心田 (四川农业大学动物医学院，动物传染病与基因芯片实验室， 四川省动物疫病与人类健康重点实验室四川．雅安625014) 摘要本研究以副猪嗜血杆茵四川分离株为材料，建立基因组表达文库。对分离纯化得到的疑似 茵落进行革兰氏染色，将革兰氏阴性且具有多种形态的分离菌进行生化鉴定及PCR方法鉴定；提取分离 株基因组DNA，然后用Sau3AI酶切基因组lh，胶回收0．5—2kb之间的DNA片段，与经BamHI酶切并去 经鉴定该分离株为副猪嗜血杆菌，并命名为SC—l株；本研究初步构建了sC一1株的基因组表达文库，文库 库容量约为16000个．随机挑选的阳性克隆外源片段PCR产物约为0．5一1．2kb。本研究成功从四川地区 分离鉴定了一株副猪嗜血杆菌sc一1株并初步构建了该菌株的基因组表达文库，为筛选副猪嗜血杆茵的 体内诱导基因奠定了基础。 关键词副猪嗜血杆茵；分离培养；基因组表达文库 副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis，Hps)属于巴斯德菌科嗜血杆菌属，是猪的重要病原菌之一。 Hps是一种多形态、非溶血性、不运动、对NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)有依赖性、革兰氏阴性杆菌，无芽 孢，兼性厌氧。Hps对营养要求严格，人工培养时必须添加NAD。Hps是猪上呼吸道的常在菌，但可突破 鼻黏膜的屏障，引起全身性的感染。包括仔猪多发性浆膜炎、多发性关节炎、脑膜炎、支气管肺炎和败血 症。目前，国内外该病的发病率和死亡率均呈显著上升趋势，已给养猪业造成较大经济损失。 副猪嗜血杆菌毒力因子及其致病机理是目前研究的重点和难点。本研究在四川某规模化猪场进行 了副猪嗜血杆菌分离鉴定，并初步构建了该分离菌的基因组表达文库，研究内容报告如下： 1材料与方法 1．1试验材料 1．1．1分离材料从四川某个患多发浆膜炎与纤维素性关节炎病的猪场采集。病猪出现咳嗽、呼吸困 难、消瘦、跛行和被毛粗乱；剖检病变表现为胸膜炎、心包炎、腹膜炎、关节炎和脑膜炎等。 1．1．2试剂材料副猪嗜血杆菌标准株(HSl075)由本实验室保存；微量生化鉴定管购自杭州天和微生物 t基金项目：教育部长江学者和创新团队发展计划资助项目(IRrm848) 作者简介：都启晶(1982一)，女(汉)。湖北南漳人．博士，研究方向为动物传染病学与分子生物学，jingdqi@yah00．com．cn 通讯作者：文心田，csanjie@sicau．edu．cn 四J I省畜牧兽医学会2010年学术年会 GelExtraction K 试剂公司；E．I．N．A minikit及E．I．N．A plasmid KitVer．2．1、Sau3AI、BamH I、碱性磷酸酶(CIAP)、Premix 购自Promega公司；DNALigation Taq酶(2x)、 DNA III Vector、标准分子量入一HindlII pMDl9一TSimple digest Marker等购自大连宝生物有限公司；Marker 购自北京天根生化科技有限公司；pRSET—a／b／c质粒由本室保存。其余生化试剂均为国产、分析纯。 1．2试验方法 1．2．1 副猪嗜血杆菌分离培养及生化鉴定按常规方法进行。无菌操作从疑似病猪的肺脏、胸腔积液、 腹腔积液、心包积液、心血、关节液、和脑组织等病料中取样，在含有NAD的胰蛋白胨大豆琼脂(TsA)平板 划线接种，37℃培养48～72h后挑取单个菌落，再进行纯培养。挑取上述纯培养菌落抹片，革兰氏染色后 观察细菌形态。将疑似菌落进行NAD依赖试验和生化鉴定。