基因工程实验前5个-新(实验日期供一班用).docVIP

课程名称基因工程 实验地点科技楼525 实验日期2012/3/性质：基础 RNA提取 1．实验目的：提取总RNA 2．实验原理：Trizol 试剂是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相的快速抽提总RNA的试剂，在匀浆和裂解过程中，异硫氰酸胍可以裂解细胞使细胞中蛋白、ＲＮＡ释放出来的同时，保护ＲＮＡ的完整性。加入氯仿抽提后离心分离，样品分成水样层和有机层，RNA存在于水相中。收集上面的的水样层，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。酒精溶解沉淀中可能的有机物杂质，二是洗掉异丙醇、氯仿试剂。 3．仪器与试剂（材料）： 4℃离心机液氮罐移液器1ml、200μl、20μl、10μl、2μl4套枪头（2盒蓝1ml、2盒黄200μl、2盒白20μl，牛皮纸包裹）、EP管（1.5ml 2饭盒、0.2μl 200ml烧杯2个，牛皮纸包裹）、研钵（4，锡箔纸包裹）、药匙（4，锡箔纸包裹）、镊子（4，锡箔纸包裹）。RNA提取用的用品用0.1%DEPC水浸泡过夜，然后消毒、烘干小麦叶片100ml 1%琼脂糖胶Trizol、氯仿、异丙醇、75%乙醇(DEPC水配制)、DEPC处理水、50×TAE、loading buffer4．实验方法与步骤：提前准备：擦实验台（先酒精、后双氧水）、开制冰机、4℃离心机、抬液氮罐 1组织100mg，液氮研磨 打开研钵，4个1.5mlEP管、1个药匙先用液氮冻一下 剪下10个叶子，放入研钵，尽量缓慢倒入液氮，研磨，待组织变软，再倒入液氮，研磨，分入4个EP管中。 2每个EP管加入1ml Trizol，枪混匀，放入冰浴，室温静置5min。（注意不要溅出Trizol） 3每管加入200μl氯仿，颠倒混匀，室温放置5min（使蛋白变性，降低蛋白的溶解度，加速有机相和水相的分层） 44℃、12000rpm，离心15min，EP管内容物分为3层（RNA、DNA、蛋白质） 5吸取上层水相RNA（200μl即可，不要全取），转移至另一新EP管（取的时候，注意计算体积） 6EP管中加入等体积异丙醇，-20℃（室温？）放置20min（沉淀RNA，降低RNA在氯仿中的溶解度，容积小且速度快。主要沉淀DNA和大分子rRNA和mRNA，对5sRNA、tRNA及多糖不产生沉淀，所以RNA电泳的标志性三条带中5sRNA带不清楚。但是难以挥发出去。） 74℃、12000rpm，离心10min 8弃上清液，加入冰预冷的75%乙醇1ml 94℃、7500rpm，离心5min（酒精溶解沉淀中可能的有机物杂质，二是洗掉异丙醇、氯仿试剂，酒精的易挥发性 在这里的到运用） 10重复⑧⑨，弃上清液，干燥5-6min，20μl DEPC处理水溶解RNA 11加入20μl loading buffer，1μl / 5μl点样，220v、150mA大约跑30min。 5．注意事项： 避免在操作中说话聊天。也可以戴口罩以防止引起RNA酶污染。 尽量使用一次性的塑料制品，尽量避免共用器具如滤纸，tips，tubes等，以防交叉污染。关于一次性塑料制品，建议使用厂家供应的出厂前已经灭菌的tips和tubes等。配制溶液用的酒精、异丙醇、Tris等应采用未开封的新瓶。 所有旧塑料制品都必须用0.5M的NaOH处理10分钟，用双蒸水彻底冲洗，DEPC-H20浸泡过夜后灭菌。无法用DEPC处理的用具可用氯仿擦拭若干次，这样通常可以消除RNA酶的活性。但氯仿会溶解某些塑料制品，应当注意。．思考题：课程名称基因工程 实验地点科技楼525 实验日期2012/3/性质：基础 1．实验目的：2．实验原理：RT-PCR 为反转录RCR和实时PCR共同的缩写。首先经反转录酶的作用从一条RNA链逆转录成 cDNA（互补DNA），再以cDNA为模板通过PCR，扩增合成目的片段。（一）预变性：破坏DNA中可能存在的较难破坏的二级结构。使DNA充分变性，减少DNA 复杂结构对扩增的影响，以利于引物更好的和模板结合。 （二）变性-退火-延伸循环：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：将反应混合液冷却至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，以第一条DNA链为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。以上三步为一个循环，如此反复。 （三）PCR仪扩增循环后72度延伸10分钟 3．仪器与试剂（材料）： 移液器1ml、200μl、20μl、10μl、2μl4套枪头（2盒蓝1ml、2盒黄200μl、2盒白20μl，牛皮纸包裹）、EP管（1.5