苯丙氨酸生物合成整体代谢网络调控基因敲除.pdfVIP

苯丙氨酸生物合成的整体代谢网络 调控基因的敲除4 黄钦耿2 吴伟斌2 施巧琴1,2 吴松刚1,2 1工业微生物发酵技术国家工程研究中心{福建师范大学}福州 2福建麦丹生物集团有限公司福州研究中心福州 [摘要]csrA基因产物是大肠杆菌芳香族氨基酸生物合成途径中碳中心代谢有关的一种 全局性调控蛋白质。采用Red敲除系统介导的同源重组的方法定位缺失大肠杆菌染色体csrA 基因，经PCR、DNA测序等多种方法证实了基因剔除的可靠性.csrA基因剔除后，大肠杆 菌芳香族氨基酸生物合成中受csrA表达产物负调控的关键酶的酶活力有所提高，而正调控 的关键酶基因活性降低，突变菌株发酵生产苯丙氨酸的能力提高近13％。 [关键词]csrA;基因敲除;苯丙氨酸生物合成;代谢调控 因实现芳香族合成过程中碳中心途径的负调控的解除或阻遏，同时加强正调控， 使既增强了理想代谢途径又抑制了竞争代谢途径成为可能。 ～。6￡互箸 图1．csrA基因编码产物参与的莽草酸途径的碳中心代谢的示意图 图中，搿+一表示受csrA基因的正调控，搿一劳表示负调控，搿×一表示不受 其调控。 本文在本研究小组构建的工程质粒的基础上，利用Red重组敲除系统对工程 宿主进行csrA基因的缺失，降低细胞碳中心代谢芳香族氨基酸途径的负调控， 降低细胞糖源摄取速率，减少细胞乙酸的生成，进一步提高L-Phe的发酵量水平。 1材料和方法 1．1材料 1．1．1菌株和质粒 K1 苯丙氨酸基因工程宿主菌Escherichiacoli2为本研究中心自行改造构 coli 建，载体克隆受体菌EscherichiaJNl09购自TAKARA；苯丙氨酸基因工程 8T载体购自TAKARA。 本室保存，pMDl 1．1．2主要工具酶和试剂 限制性内切酶、DNA聚合酶、T．连接酶等均购自TAKARA：PCR产物回收试剂盒， 胶回收试剂盒等均购自上海生工。其它药品均为国产分析纯。 1．1．3引物 49 根据genbank的大肠杆菌基因组及模板质粒pKDl3的抗性片段序列，设计 csrA的基因敲除引物如下：(其中划线部分序列为模板质粒pKDl3带有FRT识 别位点的抗性基因片段的PCR引物部分．) PI GTGT^GGCTGGAGCTGCTT0-·3 P1 CTGTCM^CATGAG从TTA^_3 同时：设计一对抗性片段内部的敲除验证引物： YZ-F=5一ATGATTG从CAAG^TGGATTGCAc_．3 YZ-R：5-TTAGAAG从CTCGTC从G从GGCG一3 1．1．4培养基 LB培养基：配方参阅分子克隆实验指南(第三版)． 工程菌种子及发酵培养基培养基：企业内部资料(略)． 1．2方法 1．2．1 csrA基因的敲除组件的构建 I对PCR产物进行37度处理Ih， PCR反应结束后，冰中放置15min，然后加入Dpn 再于冰中放置5min，电泳回收目的片段。然后将回收片段进行T-A克隆并转化大 肠杆菌JMl09，送交上海生工进行测序验证． 1．2．2Red重组酶的诱导和高效率的电转化感受态细胞的制备 00lI 将编码Red重组酶的pKD46质粒转化至大肠杆菌工程宿主当中，在含1 ml g／ml氨苄青霉素的LB培养基中30℃培养过夜，将0．5雨l培养物加入到盛有50 LB培养基的250ml锥形瓶中，30C，250rpm培养至0D600=015-0．20，加入终浓 细菌在冰水浴中冷却30mi