华蟾酥毒基诱导骨肉瘤细胞凋亡体外实验研究.pdfVIP

第六届《中华骨科杂志》论坛·基础与骨病 华蟾酥毒基诱导骨肉瘤细胞凋亡的 体外实验研究 尹军强1，谢显彪1，温丽丽2，黄纲1，邹昌业1，王晋1，沈靖南1 1．中山大学附属第一医院骨肿瘤科，广东广州510080； 2．中山大学附属肿瘤医院，广东广州510060 【摘要】目的研究华蟾酥毒基对多种骨肉瘤细胞系的增殖抑制和诱导凋亡的作用及相关作用机制。方法四甲 基偶氮唑蓝(MTT)法观察华蟾酥毒基对骨肉瘤细胞增殖活性的影响；流式细胞仪检测细胞周期，细胞核荧光染色 及AnnexiIl sa02骨肉瘤细胞的增殖，呈剂量和时间依赖性；华蟾酥毒基可诱导骨肉瘤细胞阻滞于G2／M期，并诱导细胞产生典型 凋亡小体，Amlexin 用机制为调节队Ps和Bcl．2凋亡相关蛋白活性。 【关键词】华蟾酥毒基；骨肉瘤；凋亡 华蟾素是中华大蟾蜍皮经过水化萃取而成的中药制剂，具有清热解毒、利水消肿、化瘀溃坚等 作用，目前已成为我国临床上应用较广的抗肿瘤中药制剂之一【l。3J。华蟾素毒基(Cinobuf她in，cB) 作为华蟾素中提取的主要毒性配基之一，亦具有良好的抗肿瘤作用。近年来研究发现其对肝癌、前 列腺癌多种恶性肿瘤具有良好的抗癌功效【4引，而目前华蟾素毒基素在抗骨肉瘤方面的报道较少。本 实验研究了华蟾素毒基对多种骨肉瘤细胞系生长、增殖的影响，对其作用机制进行探讨，为华蟾素 毒基在抗骨肉瘤方面的应用提供实验依据。 1材料与方法 1．1药物与试剂 华蟾素毒基购于Sigma公司，以二甲基亚砜(DMSO)溶解配制成储备原液，于一20℃保存。工作 33258 液以不含血清的培养基稀释，DMSO终浓度控制在小于5‰。四甲基偶氮唑蓝(MTT)及Hoechst V／PI染色试剂盒购于南京凯基公司；相关抗体phospho巧lated—GsK-3(ser 购于sigIm公司；A皿exin ，xIAP，cIAP-l，cleaved—Pf6d肿，H2AX，survivin及GAPDH购自CeU 9)， GSK．3 SigIlaling公 司。 BaX， ．TIlbuliIl购自SantaCmz公司。 Bcl．2，p65和 1．2细胞系 人骨肉瘤细胞系u20s、MG63及Sa02由意大利黜zzoli骨科研究所Dr．MSE心认惠赠。骨肉瘤细 乙酸(EDTA)与0．25％胰蛋白酶(1：1)混合液消化、传代。 603 第六届《中华骨科杂志》论坛·基础与骨病 1．3MTT法检测细胞增殖抑制 取对数生长期的骨肉瘤细胞180此，3×103个／孑L接种于96孔板，待细胞贴壁后，加入不同浓度的 华蟾素毒基，每组设3个复孔，培养24，48，72 MTT，继续培养4h后弃去 h后，加入10止的5g·L‘1 m1 培养液，加入0．1 DMSO，待结晶完全溶解后，在Bio—Rad550酶联免疫检测仪上以570IlIIl和630岫 双波长测定每孔的吸光度值。B1iss法计算抑制细胞生长达50％时的药物浓度，以Ic，o值表示。 1．4流式细胞仪检测细胞周期 收集100nmol·L‘1(nM)浓度华蟾素毒基处理12h后的骨肉瘤细胞， PBS洗涤两次，70％乙醇 仪，488m激发光检测细胞DNA含量，LYSIS软件分析细胞周期。 1．5Hoechst 33258荧光染色 不同骨肉瘤细胞培养于带玻片的六孔板中，2×105个／孔，培养24h细胞贴壁后加入100nM华 蟾素毒基，继续培养48h后，固定液4℃固定5min，点加Hoechst 33258染色液(10甥仰L。1)