重组SOD生产.pdfVIP

大会专题报告 重组SOD的生产 李素霞袁勤生 (华东理T大学生物工程学院上海200237) 重组SOD的研究着重在人源性SOD的研究，一方面降低了其他来源提取 SOD的免疫原性问题，另一方面也解决了人源性SOD的来源问题。按照其种类， 主要分为：人Cu，Zn．SOD，人Mn．SOD和人EC．SOD的克隆表达与发酵生产。 其中又以人Cu，Zn．SOD，人Mn．SOD的研究较为成熟。本文分别介绍了这三种 重组SOD的生产以及可能存在的问题。 1人Cu，Zn—SOD基因的克隆与表达 (1)人Cu，Zn．SOD基因在大肠杆菌中的克隆与表达 人源SOD作为一种重组蛋白由于在大肠杆菌中过度表达等原因，使工程菌 合成的SOD蛋白质分子不能及时折叠成J下确天然的二、三级空间结构，表达产 物形成包涵体，需要经过复性过程，才能转化为可溶性的有活性状态。 袁勤生实验室进行了人Cu，Zn．SOD基因在大肠杆菌中的克隆与表达，均获 得了可溶性的表达，表达的重组Cu，Zn-SOD活性高。步骤如下：取构建好的 pET-SOD分泌表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，筛选表达菌株， 用IPTG进行诱导表达，收集适量菌液经超声破碎后离心，取上清蛋白经sDs— PAGE电泳，蛋白质免疫印迹和活性染色分析。实验结果表明该工程菌可分泌表 达一相对分子质量大约16kD的蛋白质，与hCu，Zn．SOD相对分子质量大小一致， 表达量可达茵体可溶性蛋白的20％以上。 (2)人Cu，Zn．SOD基因在酵母中的克隆与表达 将酿酒酵母交配因子(MF)．信号肽序列与hCu，Zn．SOD基因融合，首次在酿 酒酵母中克隆和分泌表达了有生物活性的hCu．Zn．SOD。酵母是真核微生物，具 有不同于其他表达系统的优势：其一，与大肠杆菌不同，酵母有先进的异源蛋白 折叠途径。其二，当同时使用酵母信号序列时，酵母可以分泌经正确折叠和加工 的蛋白质。因此，有功能的和完全折叠的异源蛋白可以分泌到培养基中。不同于 哺乳动物表达体系，酵母可以在简单培养基中快速生长。随着工业规模发酵技术 的广泛应用，酵母在工业上应用于表达重要的蛋白质方面显示了极大价值。目前 用酿酒酵母等真核生物细胞作为宿主表达人源SOD的研究和开发则较少。施惠 娟等研究了hCu，Zn．SOD在甲醇酵母中的表达，其表达量及酶活性均没有大肠杆 菌表达量高，但由于酵母是真核表达系统，与E．coli表达系统相比，酵母表达的 SOD是可溶性蛋白，且N末端的Ala是乙酰化的，与天然的SOD结构一致，而 E．coli中则没有乙酰化功能，所以酵母表达外源蛋白的生物特性更接近于天然 产物，且没有内毒素污染的问题，因此用酵母表达人SOD具有很高的实用价值。 大会专题报告 hCu，Zn．SOD蛋白为一单体，理论上相对分子质量约为16kD，大小适中，适合用 酵母系统表达。 此外，由于表达蛋白的主要目的是应用于食品、化妆品生产等领域，因此在 遗传背景清楚的酿酒酵母胞系统表达是很合适的；对胞内和胞外表达产物进行蛋 白质免疫杂交和活性染色定位均检测到有活性的hCu，Zn-SOD，说明有部分人源 SOD分泌到胞外。研究结果中外源蛋白在酵母细胞中表达、分泌的情况说明实 验所用的表达宿主和载体是匹配的，并采用了正确的分泌信号肽。但还需对此分 泌表达系统的分泌效果作进一步的分析研究。 (3)人Cu，Zn．SOD基因在其它表达系统中的克隆与表达 为Ala密码子，再构建重组子，通过随机同源重组将突变后的hCu，Zn．SOD整合 blot、 入聚球藻Synechococcussp并实现表达。表达产物用SDS、PAGE、Western 酶活等方法测定均为阳性反应；热稳定性测定显示，hCu，Zn．SOD在80℃保温 30min后仍具有95％的活力，耐热能力比天然hCu，Zn．SOD有了较大的提高。蛋 白扫描结果显示目的蛋白占可溶性蛋白的3．6l％。目前市场上使用的 Cu，Zn．SOD基本上是动植物来源的，但不同物种的Cu，Zn．SOD具有种质特异性， 差异，和猕猴的Cu，Zn．SOD编码基因有22个碱基差异，故使用动植物来源的 Cu,Zn．S