以亲环素+A+为靶点高通量药物筛选模型建立与应用.pdfVIP

以亲环素A为靶点的高通量药物筛选模型的建立及应用 郑海洲郑智慧+可爱兵任晓范玉玲路新华‘ 华北制药集团新药研究开发有限责任公司，石家庄050015 摘要：亲环素A(CyclophilinA，CypA)是免疫抑制剂环孢菌素A(cyclosporinA，CsA)的胞内受体，与多种 重要生理和病理过程密切相关，已经成为如免疫抑制、抗HIV、HCV等多类药物的研发靶点。为了筛选新 方法从人外周血淋巴细胞中扩增出CypA基因，通过大肠杆菌系统重组表达CypA蛋白，并利用镍离子螯 kDa，蛋白纯度大于 合亲和层析柱进行蛋白纯化。SDS．PAGE检测重组表达的CypA相对分子质量约为19 光标记的CsA竞争结合于CypA，其IC50值为221．3nM。利用建立的筛选模型，本研究对28215个微生 物次生代谢产物粗提物进行了初筛和复筛，从中筛选得到43个抑制率大于70％的样品。经液相．质谱方法 进一步分析，其中17个真菌的发酵产物中含有CsA类化合物。方法的验证以及应用结果证明该基于荧光 偏振的CypA抑制剂药物筛选模型具有很高的灵敏度和稳定性，可以简单、快捷地进行靶向CypA的药物 高通量筛选。 关键词：亲环素A，环孢菌素A，高通量筛选，荧光偏振法 亲环素A(cyclophilinA，CypA)是免疫抑制剂环孢菌素A(cyclosporinA，CsA)的结合蛋白，位于细胞内， 信号通路中发挥关键作用，同时还在细胞生长和肿瘤发生等生理过程中具有重要作用【2’31。 研究表明以CypA为结合靶点的抑制剂CsA及其类似物，能够抑制多种病毒的复制，具有抗病毒作用【4’51， 抑制Hcv病毒颗粒的装配及释放【9iO]oCypA还可以通过与流感病毒的Ml蛋白发生相互作用而影响该病毒 复制【lI】。 总之，CypA已经成为免疫和抗病毒药物研究的重要靶点。本研究为了研究开发新型免疫抑制药物和抗 病毒药物，建立了新的基于荧光偏振方法的CypA的小分子抑制剂筛选模型。 1材料和试剂 1．1质粒和菌种 10l pGEM-T 均由本实验室保存。 1．2主要试剂和酶 l kbDNALadder，NdeI和Xho GelDNA I购自Promega公司，ExTaq，Agarose Ligation飚t为TaK丑Ra产品。 实验室保存。 2方法 2．1人CypA基因的克隆及序列测定 Vector，转入大肠杆菌DH5a，挑选阳性克隆送上海生工测序。 pGEM．T 2．2人CH}A原核表达质粒的构建及表达 I和勋DI双酶切纯化，连接转化大肠杆 将测序正确的克隆质粒pGEM-T／CypA和表达载体pET-39b用Nde mmol／L的IPTG pET一39b／CypA。接种阳性重组菌于LB／Kan培养基，37C摇培至氐00为0．5～0．6，加入终浓度l 诱导表达。离心收集菌体，通过SDS-PAGF_．检测是否有目的蛋白表达。 2．3人CypA蛋白纯化 取重组CypA表达菌接种于2 mmol／LIris．HCI 终浓度lmmol／L，28C培养过夜，离心收集菌体，用20 pH8．0缓冲液混悬洗涤，再用裂 X．100，2mM 解液(1xPBS，0．1％Triton DTT)超声破碎菌体，高速离心收集上清液，用镍离子亲和柱纯 8．0，50mM mM 化，洗脱缓冲液(50 imidazole)洗脱收集样品 mMIris-HCI，pHNaCI，5％glycerol，200 峰，制备样品进行12％SDS．PAGE检