双峰驼CYP3A酶体外活性检测方法建立.pdfVIP

第四部分 骆驼创新技术研究 双峰驼CYP3A酶体外活性检测方法的建立 裴乐1 张文彬2 巴拉2哈斯苏荣1·4 (1内蒙古农业大学兽医学院，呼和浩特，010018； 2内蒙古阿拉善骆驼科学研究所，巴彦浩特，750300) 最主要的功能形式。本研究将初步建立双峰驼肝微粒体细胞色素CYP3A药物代谢检测平台，对钙离子沉淀法制备的 肝微粒体蛋白含量进行了测定，并同时对CYP450总酶含量、细胞色素b5酶的含量以及CYP3A的体外活性进行了检 o．397±o．0803 体细胞色素CYP酶系其他亚型及CYP酶系体内活性等相关深入研究奠定了基础。 关键词：双峰驼；肝微粒体；CYP3A；体外代谢 双峰驼是一种主要生活在沙漠、戈壁、荒漠草原上的特有畜种，它具有极强的耐极端气候、耐饥 渴、耐高盐等特性，然而双峰驼的相关科学研究相对滞后。药物在双峰驼体内的生物转化主要经肝微 粒体细胞色素CYP酶系催化而完成，可见CYP酶系决定着药物在双峰驼体内的治疗效果和安全性。 细胞色素CYP酶系是一组含血红素的蛋白质，由结构和功能相关的基因超家族编码形成的超家族酶 内的代谢转化过程。关于CYP3A的研究已有近60年的历史，研究内容涵盖CYP3A的功能、结构、 遗传多样性、影响酶活性以及与处置外来化学物的相关性等，均取得了突破性进展【2’3】。在原核生物 中，CYP酶系可催化多种生化反应，在外源性和内源性化合物代谢中起着非常重要的作用。而对动物 而言，CYP主要生理功能是参与内源性物质和外源性物质的生物转化，在调节机体与外环境的相互作 用以及保持机体内环境稳态中起着重要作用【4。J。 本研究采用体外研究方法，对双峰驼CYP酶系开展相关研究，为后期的深入研究奠定基础。由 于体外药物代谢研究可排除体内诸多的干扰因素，直接观察到药物代谢酶对底物的选择性代谢，为体 内代谢研究提供重要的线索和依据。 ·101· 2013中国驼业进展 1材料与方法 1．1主要仪器设备 3-30K、BECKMANCOULTER 超高速离心机(Sigma 外分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)、恒温水浴锅(DK．81，上海森信实验仪器有限公 Scientific)。 司)、恒温箱(上海福玛实验设备有限公司)、一80℃冰箱(Forma 1．2试验材料和试剂 TRIS—BASEBiocheInicalGrad(A ofTheDowCheInjcal Subsidiary 蛋白定量试剂(天根生化科技有限公司公司，J9104)、甲醛(天津市科盟化工工贸有限公司)、红 霉素(中国药检所)。 1．3改良钙离子沉淀法隅1制备肝微粒体 双峰驼禁食过夜，颈静脉放血处死，迅速取出肝脏，用冰冷的生理盐水洗涤，去除血污，滤纸吸 干水分，分装至冻存管中，置液氮冷冻，送回实验室。取冷冻保存肝脏转入小烧杯，吸干水分称重后， 7．4)，制成肝 在冰浴中剪碎，按3mL／g(缓冲液体积／肝脏重量)的比例加入Tris·HCl缓冲液(PH 4℃离心15rain，弃去沉淀部分(细胞核、细胞碎片及线粒体)，上清液中按10：1 匀浆。12500rpm mmol／L 加入88 CaCl2溶液，搅匀，置于冰浴中5 4℃离心15min，弃去上清液，沉 min。27000rpm 淀部分为肝微粒体。将经过PBS缓冲液(PH 7。4)清洗后的肝微粒体按0．5mL／g(缓冲液体积，肝脏重 量)的比例重新悬浮于PBS缓冲液和20％甘油的混合液中，混匀分装于冻存管中，一80℃冻存。 1．4 BCA法【9】测定肝镁粒体蛋白含量 1．4．1 BSA系列浓度溶液的配置 取9支干净的离心管并编号，以缓冲液