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中国齑牧兽医学会动物繁殖学分会第f四届学术研讨会论文集
一氧化氮合酶在猪早期胚胎发育中表达的初步研究
刘继龙,谢体三,王慧英,谭世俭
广西入学动物繁殖研究所广西,南宁,530005
摘要本研究首次运用分子生物学手段探究了一氧化氮(N0)在猪早期胚胎发育过程中的表达情况以及相关的规律。应用RT—PcR
果表明:iNOS在猪早期胚胎发育的整个过程中都有表达,其相对表达量随着胚胎发育的进程呈现上升的趋势,在桑椹/囊胚阶段
达到最高;eN0s仅仅是在2一细胞期和4一细胞期有表达,其相对表达量较稳定;在猪早期胚胎发育过程中,iNOs的相对表达量高
程所必需的,对胚胎的附植可能起着重要的生理调节作用。
关键词猪,一氧化氮,mRNA,RT—PCR,胚胎发育
一氧化氮(n耐c
巢中,并对雌性动物卵泡的发育、卵母细胞减数分裂、排卵有调节作用,同时还参与胚胎着床、妊娠维持、分娩调节等
生育环节;而对雄性动物则主要是调节睾丸微循环,参与睾酮分泌,影响精子发生,调节精子活力及其受精能力等。
动物早期胚胎的发育是个体发育的重要阶段,其发育过程受到体内各种冈索的调节和影响。长期以来,人们对
NO这一气体信号分子可能产生的生理调节作用了解较少,国内外在这一领域的研究工作尚处在初级阶段:目前我
国在家畜方面很少有相关的研究报道,在大型家畜领域尚未有相关的报道。为了探讨NO对猪早期胍胎发育的调节
机理,我们采用RT.PCR的方法对猪早期胚胎发育过程中NOSmRNA的表达情况进行了分析研究。
1.材料与方法
1.1材料
1.1.1菌株与克隆载体
大肠杆菌DH5a为本实验室保存;pMD18.TVector购自TaK且Ra宝生物工程有限公司。
1.1.2主要试剂
微量样品RNA快速提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司;Pm
dGTP)及各种限制性内切酶购自宝生物工程(大连)公司;DNA
限公司;PCR引物委托北京赛百盛基因技术有限公司合成。
1.1.3引物的设计与合成
mI埘A、eNOS
根据NCBI中Genebanl(提供的iNoSHl】刚A基冈序列,用PCR引物设计软件一OLIGO6.0设计特
1.2.方法
1.2.1总鼢峨的提取
总I州A。然后取5lj
值在1.8~2.0。
1.2.2目的基因的获得
Bu脆r l,Ribonuclease
l反应体系中,含I州Ag,5X
(1)cDNA第一链合成在25U 2lJ 5lJ Inhibitor(40U/IJI)
water。
l,dNTP l,Radom 1,其余部分为DEPC·仃eated
2U mix(10mM)2IJl,M.MLV(200L巾1)llJpnmer(1IjM)2IJ
70℃变性5
miIl,置.20℃中保存备用。
(2)目的基因的PCR扩增以反转录所获得的产物为模板进行PCR扩增,反应在15ul反应体系中进行:10X
Bu腩r l,dNTP l,Pm l,反转录产物cDNA2¨l,iN
P如Taq 1.5IJ mix(2.5mM)1.2UTaqpolymerase(5U/p1)0.2IJ
作者简介:刘继龙(19引一),男,广西岑溪人.硕一仁研究生。
通讯作者:谭世俭,研究员。E—mail:啪sj@黔u.edu.∞
479.
十目《《*K{2自%%m}ne*}口%々$Ⅱ”☆&z*
O趾N0s
Pnmer(20pM)各l0p1,ddH20
7mm
eNOs扩增条什为:94℃5m
m.94℃30s,5s℃30s,7
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