一氧化氮合酶在猪早期胚胎发育中表达初步研究.pdfVIP

中国齑牧兽医学会动物繁殖学分会第f四届学术研讨会论文集 一氧化氮合酶在猪早期胚胎发育中表达的初步研究 刘继龙，谢体三，王慧英，谭世俭 广西入学动物繁殖研究所广西，南宁，530005 摘要本研究首次运用分子生物学手段探究了一氧化氮(N0)在猪早期胚胎发育过程中的表达情况以及相关的规律。应用RT—PcR 果表明：iNOS在猪早期胚胎发育的整个过程中都有表达，其相对表达量随着胚胎发育的进程呈现上升的趋势，在桑椹／囊胚阶段 达到最高；eN0s仅仅是在2一细胞期和4一细胞期有表达，其相对表达量较稳定；在猪早期胚胎发育过程中，iNOs的相对表达量高 程所必需的，对胚胎的附植可能起着重要的生理调节作用。 关键词猪，一氧化氮，mRNA，RT—PCR，胚胎发育 一氧化氮(n耐c 巢中，并对雌性动物卵泡的发育、卵母细胞减数分裂、排卵有调节作用，同时还参与胚胎着床、妊娠维持、分娩调节等 生育环节；而对雄性动物则主要是调节睾丸微循环，参与睾酮分泌，影响精子发生，调节精子活力及其受精能力等。 动物早期胚胎的发育是个体发育的重要阶段，其发育过程受到体内各种冈索的调节和影响。长期以来，人们对 NO这一气体信号分子可能产生的生理调节作用了解较少，国内外在这一领域的研究工作尚处在初级阶段：目前我 国在家畜方面很少有相关的研究报道，在大型家畜领域尚未有相关的报道。为了探讨NO对猪早期胍胎发育的调节 机理，我们采用RT．PCR的方法对猪早期胚胎发育过程中NOSmRNA的表达情况进行了分析研究。 1．材料与方法 1．1材料 1．1．1菌株与克隆载体 大肠杆菌DH5a为本实验室保存；pMD18．TVector购自TaK且Ra宝生物工程有限公司。 1．1．2主要试剂 微量样品RNA快速提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；Pm dGTP)及各种限制性内切酶购自宝生物工程(大连)公司；DNA 限公司；PCR引物委托北京赛百盛基因技术有限公司合成。 1．1．3引物的设计与合成 mI埘A、eNOS 根据NCBI中Genebanl(提供的iNoSHl】刚A基冈序列，用PCR引物设计软件一OLIGO6．0设计特 1．2．方法 1．2．1总鼢峨的提取 总I州A。然后取5lj 值在1．8～2．0。 1．2．2目的基因的获得 Bu脆r l，Ribonuclease l反应体系中，含I州Ag，5X (1)cDNA第一链合成在25U 2lJ 5lJ Inhibitor(40U／IJI) water。 l，dNTP l，Radom 1，其余部分为DEPC·仃eated 2U mix(10mM)2IJl，M．MLV(200L巾1)llJpnmer(1IjM)2IJ 70℃变性5 miIl，置．20℃中保存备用。 (2)目的基因的PCR扩增以反转录所获得的产物为模板进行PCR扩增，反应在15ul反应体系中进行：10X Bu腩r l，dNTP l，Pm l，反转录产物cDNA2¨l，iN P如Taq 1．5IJ mix(2．5mM)1．2UTaqpolymerase(5U／p1)0．2IJ 作者简介：刘继龙(19引一)，男，广西岑溪人．硕一仁研究生。 通讯作者：谭世俭，研究员。E—mail：啪sj@黔u．edu．∞ 479． 十目《《*K{2自％％m}ne*}口％々$Ⅱ”☆＆z* O趾N0s Pnmer(20pM)各l0p1，ddH20 7mm eNOs扩增条什为：94℃5m m．94℃30s，5s℃30s，7