五龙鹅热休克蛋白70的表达提纯和其结合抗原肽形成复合物的特性研究.pdfVIP

生物技术的应用与生物安全 445 五龙鹅热休克蛋白70的表达 提纯及其结合抗原肽形成复合物的特性研究。 吴晓平“ 王宝维一 张旭晖 贾晓晖 张名爱 龙芳羽 杨志刚 王 雷 (青岛农业大学优质水禽研究所青岛266]09) 摘要：目的：为研究HSP70在热应激时的特异性表达、组织中HSP70的分离纯化及其结合抗原肽形成复合物的特性， 设计此试验；方法：选取6w健康五龙鹅60只随机分为3组，对照组鹅不经热处理，试验1组鹅进行1次42±l℃、5h的急性 热处理后立即宰杀，试验2组鹅经热处理后在正常饲养务件下恢复12h后宰杀。取心脏，常规石蜡切片做免疫组化试验； 化后的HSPT0和人工合成的乙肝病毒前SI多肽相结合形成复合物，以双特异抗体夹心法检测其复合物的形成；结果：研究 结果表明：热应激状态下心肌纤维中有广泛的HSP70阳性颗粒，试验组1中HSP70表达重点部位在核膜及其周围，阳性细 胞率为76．O％；而试验组2中鹅心肌HSPT0表达重点转移到胞膜周固，阳性细胞率为88．4％；通过两套纯化方案纯化蛋白 HSPT0纯化物形成复合物，经双特异性抗体夹心法检测复合物的形戍，检测结果为阳性，复舍物效价为1：81，说明实验中有 复合物的形成；结论：热应激时HSP70的特异性表达重点在不同时间段有所转移，暗示HSPT0在细胞保护中可能行使一定 晦功能；在低压层析条件下可以得到高纯度的HSPT0蛋白，相比较而言，分子筛初步分离、ConA琼脂糖层析和ADP琼脂糖 层析这一流程的纯化效果更好；在体外一定条件下，人工合成肽可以和HSPT0相结合形成复合物，这将为进一步证明复合 物的免疫作用提供试验基础。 关键词：热应激；鹅；HSP70；表达；提纯；病毒复合物 1 引言 Shock 热休克蛋白(Heat Protein，HSP)是一组所有的细胞能在应激情况下由热休克基因编码合成的、序 列高度保守的伴随细胞蛋白，作为一种“细胞因子”和运载抗原进入细胞免疫途径的特殊载体¨’2J，探讨其 表达规律、提纯方式和多肽结合特性，可以为进一步验证HSP70的免疫佐剂样功效提供试验和理论基础。 发现，将42日龄的肉鸡置于35．7℃时，比较体温变化与HSP70在肺组织中表达量的变化关系，结果显示， 随着体温的升高，HSP70的含量也显著升高H】。研究发现，HSPTO的表达是机体处于应激状态的有效指 达规律和HSP70的生理功能密切相关；而目前在国内，分离纯化HSP70必须和快速蛋白液相层析系统 卷9期的2084—2090页发表。 tg,-tlD通讯作者：王宝维(1959一)．男。山东荣成人，教授．主要从事家禽科学方面的研究。E—mail：wangbw@qatt．edu．∞。 2008学术年会 (FPLc)相结合，在常规实验室条件下，从组织中直接分离纯化HSP70是极其困难的旧J，因此研究在常规试 验条件下简便快速的纯化流程是本试验的重点；本试验采用人工合成乙肝病毒(HBV)的前s1抗原(Pre 复合物中的合成多肽；合成抗原在体外一定条件下和试验纯化的HSP70相结合，并以双特异抗体夹心 ELISA检测复合物的形成，证明了HSPT0所具有的结合抗原肽的能力，并为以后进一步证明复合物的免疫 活性提供实验基础。 2材料和方法 2．1 材料 2．1．1试验动物6w健康五龙鹅60只，随机分为3组，每组20只。 2．1．2主要试剂Sephacryl 一9000免疫组化染色试剂盒(zYMED)。 2．2方法 2．2．1 实验动物的处理试验鹅随机分为3组，分别为对照组、试验1组、试验2组，其中对照组不做处 之后宰杀，取心脏，切成lcm×lcmXO．5cm组织块以备组织切片之用。取肝脏剔除脂肪和结缔组织，割成 小块，液氮速冻后一70℃保存，以备提纯之用。 2．2．2组织切片HE染色及免疫组化试验常规组织切片制作，复水后一部分用作常规HE染色，另一 部分用作免疫组化试验。 X 滴加辣根酶标记链霉卵白素液，37℃孵育10～15min；PBS冲洗3min3次；DAB+H202显色。 结果判定：每只鹅的切片取lo个640倍视野，计算阳性心肌细胞数，心肌细胞总数的比率，即阳性细 (++)。 2．2．3制备肝脏组织