苜蓿中光诱导型启动子柠檬酸合成酶基因的过量表达和其对铝耐受力的提高.pdfVIP

苜蓿基础研究 苜蓿中光诱导型启动子柠檬酸合成酶基因的过量表达 及其对铝耐受力的提高 张丽，甘智才，胡清泉，玉永雄木 (重庆高校草食动物工程研究中心／重庆牧草与草食家畜重点实验室，西南大学重庆400716) 摘要柠檬酸合成酶是调控TCA循环中的关键酶，柠檬酸合成酶基因的过量表达可促进植物中 柠檬酸的过量分泌。已有的研究表明，柠檬酸的过量分泌能增强植物对酸性土壤中铝毒的耐受性。本 研究以农杆菌介导法将携带光诱导特性的rbcs启动子的烟草柠檬酸合成酶基因转化紫花苜蓿，以期提 高酸性土壤中紫花苜蓿对铝毒的耐受能力。通过PCR及RT-PCR检测结果表明，获得了带有目的基因 的转基因植株，并检测到目的基因在RNA水平上表达。通过酶活性分析以及铝毒耐受性进一步检测， 结果表明获得的转基因植株比对照对铝毒具有更强的耐受性。 关键词柠檬酸合成酶基因；耐铝性；农杆菌介导法；紫花苜蓿 在全世界范围内约有40％的酸性土壤，铝离子，尤其是A13+对许多作物致毒的主要形式。在酸性 土壤中，铝离子首先抑制植物根的生长以及抑制植物根的生长发育，从而导致作物减产。常规的农业 措施是施用石灰和有机肥，降低土壤中的pH以消除铝毒。然而，这些措施往往成本高且难以长效。在 对许多耐铝植物的研究中发现，植物根系分泌的有机酸对土壤中的铝离子有很好的抵御作用。从根系 中分泌出的有机酸与铝离子发生络合，阻碍铝以离子形式进入植物根系，从而降低了铝对植物的毒害。 sativaL．)为多年生豆科牧草，因其具有产量高、品质好等优点被誉为“牧草 紫花苜蓿(Medicago 之王”。然而，我国南方地区存在温热多雨和酸性土壤等环境因素，限制了紫花苜蓿的生长，制约紫花 苜蓿在南方大面积种植。铝毒害是酸性土壤中最主要的问题之一。传统解决该问题的主要方法是向土 壤中施加石灰和有机肥，但成本太高且可操作性差。目前，着手解决铝离子对植物的毒害这一重大问 题。DelaFuente[1]发现在将从细菌中分离出的柠檬酸合成酶基因导入烟草和番木瓜中后，转基因烟草 中柠檬酸合成酶的表达水平比对照提高了2．3倍，根部中柠檬酸合成水平提高10倍。转基因番木瓜在 3009m／L的铝浓度下仍能生根且根系生长良好；而对照在509m／L铝浓度下其根系生长受显著抑制。L 6pez—Bucio(2000)【2j从绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)中分离出利用花椰菜花叶病毒启动子序列 (CaMv35S)作为启动子的柠檬酸合成酶编码区的基因，通过农杆菌介导法获得转基因烟草，经鉴定 的cDNA，利用胡萝卜的悬浮细胞作为实验材料，通过农杆菌转染法将其导入胡萝卜细胞。实验结果 表明线粒体CS在胡萝卜细胞中过量表达提高了柠檬酸合成酶活性，增加了柠檬酸分泌量。Koyama等 cv Westar)，实验 量明显提高。Anoop等(2003)tS]将从拟南芥中分离的mtCS，转化油菜(Brassicanapus 结果证实过量分泌柠檬酸可增强作物对铝的耐受性。在150．2001aM浓度的铝溶液中，转基因油菜生长 @中国畜牧业协会草业分会41 第三届中国苜蓿发展大会 究埕现，转基固植株比对照在酸性铝毒土壤l。其根更长，根尖吸lf5[钒离子减少。国内学者胡利华等从 假单胞杆苗基因组分离克隆出柠檬酸合成酶基因构建表选载体，利用根癌农杆菌介导法将其转入水稻， 因在水稻已经表达，但Nothem分析其表达量不足很高”。 本研究毗多年在西南地区选育的西南一号紫花苜精为材料，以光诱导启动于rbcs启动的烟草柠檬 酸台成酶基因，通过农杆茸介导法转化紫花苜蓿。以期利用商效启动丁在紫花苜蓿中表达烟草的cs 基因，增强紫花菖精柠檬酸分泌，获得耐酸铝性紫花苜蓿新品种，为加快南方苜蓿产业化进程怍有益 探索。 1材料与方法 11植物材料 南方苜蓿新品种渝苜一号紫花苣蓿：田间材料及组培室无茁材料。 1．2农杆菌苗株和质柱