嗜水气单胞菌气溶素的原核表达及其多克隆抗血清的制备.pdfVIP

第33卷 第 3期 华 中 农 业 大 学 学 报 Vo1．33 No．3 2014年 5月 JournalofHuazhongAgriculturalUniversity May2014，65~ 71 嗜水气单胞菌气溶素的原核表达 及其多克隆抗血清的制备 杜 娜 顾泽茂 袁军法 林 蠡 翟艳花 刘学芹 罗宇 良 华中农业大学水产学院／淡水水产健康养殖湖北省协同创新中心／ 农业部淡水生物繁育重点实验室，武汉430070 摘要 根据GenBank中致病性嗜水气单胞菌 (Aeromonashydrophila)气溶素 (aerolysin，Aer)基因的序列 设计引物，以来 自湖北的鱼源A．hydrophila分离株为模板扩增出aer基因的ORF序列，克隆到 pMD18一T载体 上进行序列测定。测序结果表明，A．hydrophila的aer基因的系统进化树中国内菌株聚为一支，国外菌株聚为 一 支。通过 pET-32a(+)载体构建Ahl5株aer基因的表达载体 pET32a-15，转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS 中进行诱导表达，通过SDS分析，显示与预期大小约 72．2ku相吻合 的融合蛋 白带，且以包涵体形式存 在。浓缩后的包涵体蛋白免疫新西兰大白兔获得了重组蛋白的抗血清，Westernblot结果显示 ，兔抗血清可以识 别A．hydrophila的重组毒素，说明该基因的重组蛋白具有很好 的免疫原性，可作为A．hydrophila基因工程疫 苗研制的候选基因。 关键词 嗜水气单胞菌；气溶素；原核表达 ；多克隆抗血清 中图分类号 S917．1 文献标识码 A 文章编号 1000-2421(2O14)O3—0065一O7 嗜水气单胞菌 (Aeromonashydrophila)隶属 ku_l9]。研究结果表 明，Aer是 A．hydrophila的重 于气单胞菌科(Aeromonadaceae)气单胞菌属 (AP卜 要共同保护性抗原之一[1 ]，朱大玲_1。]克隆了A． omonas)，是人、畜及水生动物共患的条件致病菌， hydrophila强毒株 XS91—4—1的aer基因全序列，为 也是气单胞菌属的模式种[1]。该细菌广泛存在于水 Aer的进一步研究奠定了基础。郭闯等_l1]虽直接 环境和土壤中，是多种水产动物的主要致病菌。由 从A．hydrophila培养上清中纯化得到Aer并制备 A．hydrophila导致的淡水鱼类细菌性败血症，对我 单克隆抗体，ELISA检测具较高阳性率，但 Aer仍 国淡水养殖业的危害尤为严重，每年都会造成严重 为粗提毒素，且蛋 白回收率仅为 15 。 的经济损失甚至导致生态污染[2]。国内外学者针对 迄今为止，A．hydrophila造成了淡水鱼类的大 A．hydrophila及其引起的病害开展了大量研究，已 量死亡，而对引起的淡水鱼类细菌性败血症主要依 经确认了该菌的致病性与毒力因子密切相关。其毒 靠抗生素治疗，大量使用抗生素类药物必然导致耐 力因子分为两类，一类是外毒素，主要包括气溶 药菌株的产生，不仅对有效防治这种疾病带来阻碍， 素[引、溶血素[、胞外蛋白酶[；另一类是内毒素，主 抗生素类药物在水产品和环境中的残留还对人类健 要包括 S层_6]、脂多糖[及 4一型鞭毛 8¨]。 康产生威胁 。A．hydrophila疫苗的研制和应用受 气溶素(Aer)是A．hydrophila的主要毒力因 到了广泛关注，不过，由于A．hydrophila抗原成分 子之一，目前在 GenBank中可以搜索到世界各地提 复杂，且存在众多血清型，不同地区流行的菌株在毒 交的气溶素基因序列约 100多条。该基因编码的 力和免疫原性等方面存在着明显差异，导致该菌的 Aer蛋 白是细菌通道形成毒素，具有溶血性、细胞毒 灭活疫苗使用受到限制。因此 ，在寻找该菌的共同 性和肠毒性，由463个氨基酸组成，分子质量约51．5 保护性抗原 的基础上研制疫苗，是提高 A 一 收稿 日期：2013—05—26 基金项 目：湖北省杰出青年人才基金项 目(2011CDA091)和中