胃病患者胃黏膜真菌基因多样性研析.pdfVIP

胃病患者胃黏膜真菌基因多样性分析 王垂杰1郑剑玲2宫雁冰2傅纪婷1齐贺2耿薇2李玉锋1段薇2 l辽宁中医药大学附属医院消化科(110032)2辽宁省基础医学研究所(110101) 0．引言 胃黏膜损伤严重影响患者的消化功能和生活质量，其中胃黏膜层和固有腺体的慢性炎症性损伤诊 断为慢性胃炎，当黏膜病损超过黏膜肌层则诊断为胃溃疡，当细胞出现异型性诊断为肿瘤．现有研究 认为导致胃黏膜炎症损伤及转化的机制与幽门螺杆菌等微生物感染有密切关系，且有研究发现，胃 溃疡合并真菌感染者溃疡口愈合进程明显延长，溃疡面积明显大于单纯性溃疡在胃癌组织样本中也 常可检出真菌，且真菌产生的毒素与肿瘤发生密切相关。目前对胃粘膜真菌多样性及进化方向与病 transcribed 损程度的关系，尚缺乏研究．本实验通过检测胃黏膜白色念珠菌的ITS(internal spacer region)序列基因多样性，分析真菌菌株进化方向与胃黏膜病损的关系，初步探寻胃黏膜损害密切相 关真菌菌株。 1．材料和方法 1．1材料2008年7月7日至8月25日于辽宁中医药大学消化科胃镜检查的患者，经知情同 意，自愿参加本项研究，共65人．其中慢性胃炎52人，胃溃疡11人，胃癌2人．男性43名，女性 22名，年龄18．79岁，平均年龄为46．32岁，近三个月内未使用糖皮质激素等免疫抑制剂用胃镜钳 取胃窦部黏膜组织样本，约3x2xlmm大小，置于无菌Ep管中，．20C保存同时记录受检者年龄、 性别、学历、吸烟、饮酒习惯、病史、病理诊断、用药治疗、快速尿素酶检查幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori，Hp)情况。 1．2方法 1．2．1真菌分离培养：胃黏膜样本加入200ul生理盐水稀释，吹打混匀．取20ul样本液，接种于 CHROM agar念珠菌显色培养基(郑州博赛生物技术股份有限公司)，37℃培养3天．参照产品说明 书，依据分离培养菌落颜色进行鉴定(白色念珠菌呈绿色，热带念珠菌呈蓝色，光滑念珠菌呈紫色， 克柔念珠菌呈粉色，其余念珠菌呈白色)用无菌牙签挑取单个菌落于Ep管中，．20℃保存。 1．2．2 白色念珠菌DNA提取：按照病损分组，选取真菌菌株样本5ul，接种于lml液体沙保罗 培养基(杭州天和微生物试剂有限公司)中增菌．菌液加入5山溶细胞酶(3mg／ml，以山梨醇溶液配 制)(Sigma，US)，37℃水浴过夜，去细胞壁．常规酚．氯仿法提取DNA。 1．2．3 ITS4：TCCTCCGCIT 体系(50肛1)t：41山H20，5．CIm10xbuffer，1山10ram 引物，0．5山20州后引物，O．25山5U，m 291．循环条件：95℃热启动5mira 4C保存．20％琼脂糖1X 料染色，110V 科技有限公司)，并记录实验结果．将PCR阳性产物送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测 No．)， 一354— 进行序列比对分析。 (Molecular Genetics Evolutionary tree)建立进 化树。 对ITS序列检测结果、病理诊断、Hp、年龄、性别、学历、吸烟、饮酒习惯等各观察指标进行比较 分析．P0．05为有统计学意义． 2．结果 2．1 agar念珠菌显色培养基中，仅有一个样本(菌株ZB066)呈紫色菌落为光滑念珠菌，来自胃癌样本． 其余均呈绿色菌落为白色念珠菌，检测结果见图1． 2．2 ITS序列PCR扩增结果：34个真菌菌株样本均可扩增出1TSl．ITS2基因序列，PCR产物 白色念珠茵为535bp，光滑念珠菌为871bp，见图2． 2．3 ITS序列分析：样本按照病理损害程度分为4组：A组：病理损害达黏膜浅层的样本(包 括浅表性胃炎、萎缩性胃炎)，随机取7个样本；B组：病理损害达黏膜下层，出现糜烂(包括浅表 性胃炎、萎缩性胃炎)，随机取7个样本；C组：病理损害达到黏膜肌层(胃溃疡)，随机取2个样 本；D组：细胞出现异型性(胃癌)，取2个样本，进行ITS序列检测