与家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin-3相互作用蛋白的筛选.pdfVIP

江苏农业科学 2015年第43卷第 1期 一 37一 王明慧，毛钰霞。许雅香．与家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂 serpin一3相互作用蛋白的筛选[J]．江苏农业科学，2015，43(1)：37—40 doi：10．15889／j．issn．10o2—1302．2015．O1．011 与家蚕丝氨酸蛋 白酶抑制剂 serpin一3 相互作用蛋白的筛选 王明慧 ，_，毛钰霞 ，许雅香 (1．苏州大学基础医学与生物科学学院，江苏苏州215123；2．现代丝绸国家工程实验室／苏州大学，江苏苏州 215123； 3．苏州大学蚕桑研究所，江苏苏州215123) 摘要：丝氨酸蛋 白酶抑制剂超基因蛋 白质家族，参与调节昆虫体 内多种生理反应。本研究在体外原核表达 6His—Bmserpin一3，以此作为饵蛋白，采用 His—pulldown技术及 SDS—PAGE分析，从家蚕血液中筛选出了能与 Bmserpin一3结合的2个蛋白质，分子量分别为83．04、83．57ku。对家蚕幼虫sp一2、sp一3在不同组织的表达变化分 析可知 ，sp-2在脂肪体、血淋巴中表达量比较高，sp一3在精巢、脂肪体、血淋巴里表达量比较高。 关键词：家蚕；pull—down；蛋白相互作用 中图分类号：$881．2 文献标志码 ：A 文章编号：1002—1302(2015)01—0037—03 Serpin全称为 serineproteaseinhibitor，是一类能够抑制丝 CATAGATCCGAACACCCTAAG一3(下划线为 NheI酶切位 氨酸蛋白酶活性的超家族蛋白质，参与调节生物体内多种生 点)和 R：5 一 ACG CTATAGTACTI~ATAATC— 理反应，包括血液凝集、纤维蛋白溶解、补体激活、免疫黑化、 CCCATCG一3(下划线为SalI酶切位点)。扩增条件是 ： 生长发育过程中组织构建等 。Serpin在昆虫各组织中均 95℃预变性 3rain；95℃变性30S，60．4℃退火35s，72℃ 有分布，对昆虫的生命活动起到重要作用，目前关于家蚕 Ser- 延伸3min，33个循环；最后72℃终延伸 10min。将PCR扩 pin的研究很多，但是几乎没有关于家蚕Serpin相互作用蛋白 增产物与pET一28a(+)进行双酶切 ，然后再将其 目的片段与 方面的研究，生物的生命活动主要体现在蛋白质水平，许多蛋 pET一28a(+)连接，转化至 EcoliTopl0中，挑选阳性克隆 白是通过与其他蛋白相互作用来发挥作用的，因此，研究蛋白 进行酶切鉴定及测序检验。 质相互作用能更好地理解生物的生命活动。本研究原核表达 1．3 重组表达载体的诱导表达 并纯化了Bmserpin～3蛋白，应用 pull—down 及质谱技术筛 含家蚕 serpin一3全长 cDNA的阳性菌株在含 30ms／L 选到Bmserpin一3的相互作用蛋白，并通过荧光定量 PCR技 卡那霉素的IJB培养基中加入诱导剂异丙基硫代 一 一D一半 术初步探索 了这 2个基 因的组织分布 ，旨在为深入探讨 乳糖苷 (IPrG)至终浓度为0．5mmol／L，37℃诱导表达6h Bmserpin一3的功能机制提供依据。 后 ，4℃5000r／rain离心10min收集菌体，用PBS重悬，在冰 浴中超声破碎 ，直到溶液变澄清。4℃ 5000r／min离心 1 材料与方法 10min，收集沉淀即得包涵体形式的6His—Bmserpin一3。 1．1 材料 1．4 重组蛋白的纯化、鉴定 家蚕品种为笔者所在研究室保存的大造，正常桑叶育，取 4℃5000r／min离心20min收集细胞