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第四届中华骨科杂志论坛天津·2012
富血小板血浆凝胶复合脑源性神经生长因子修 的骨髓干细胞
在脊髓半横断损伤中的应用
浙江大学医学院附属第二医院骨科杭州310009
赵飞齐义营徐 陈其 陈维善
脊髓损伤导致神经功能严重障碍，哺乳动物脊髓神经再生一直是世界性的难题，神经不能重新生长并
与其下一级神经元形成有效的突触联系，往往归因于脊髓损伤后形成的空洞及其积的型胶质细胞阻碍
了神经的再生以及中枢神经本身再生能力较差等原因。基闪修 的干细胞移植治疗脊髓损伤在很多试验中
都表现出很大的潜能，其中以骨髓干细胞具备来源广、增殖快等特点而备受研究者们的青 。富血小板血
的作用。
们通过体外实验来证明PRP能否诱导BDNF修的骨髓干细胞向神经元方向分化，以及在大鼠半横断脊髓
损伤模型中联合BDNF修的骨髓干细胞和PRP移植治疗后的效果。
1材料与方法
1．1试剂、仪器与材料
Fluor488 Probes公司，GFAP、NF一200抗体
连宝生物公司，CM-Dil及Alexa 抗兔荧光二抗购自Molecular
E1isa试剂盒购自
武 德， 凝血酶及Hoechst
SP5，Leica)。
介导BDNF的腺病毒颗粒由上海基因公司构建，基冈序列参考Genebank中大鼠脑源性神经生长因子基因
1 ：
序列NM02513．3(上游：5 ， 下游
5一TCACcATGGTGGcGACCGGTCTTCCCCm从TGGTc一3
)。107只雌性SD大鼠，由浙江大学实验动物中心提供，
体重212—2809。
1．2细胞培养及目的基因转染
4周龄SD大鼠雌雄不限，将其拉颈处死，75％酒精浸泡10min，无菌条件下取出股骨，除去骨周围的
肌肉组织，剪开骨两端，显露骨髓腔，用lOmL注射器，以MEM培养液从一端冲洗骨髓腔，将骨髓冲到
平皿中， 用吸管反复 打液使其成为单细胞悬液。7天后开始传代，培养到第三代后同构建好的带目的基
体外实验，分三组：(1)MSC组：单纯3×105BMSC：(2)PRP／MSC组：3×105BMSC和lOglPRP混合培养：
(3)PRP／BDNF—MSC组：3×i05BDNF-MSC和lOglPRP混合培养；2天更换一次PRP和培养基，共培养7
天和14天时检测各组GFAP、NF一200、MAP2、p70S6K的mRNA表达量。
1．3 PRP凝胶及复合干细胞支架的制备
×105，PRP中具体生长因子的浓度未作检测。PRP复合细胞支架制备：5pl细胞悬液(3x105BMSC或
BDNF—MSC)、IOPlPRP和lOOIU凝血酶的充分混合后，置于细胞培养箱中备用。
1．4实验动物分组、大鼠半横断模型的建立及移植
u pl
87只雌性SD大鼠分为五组：1．PRP组(n=12)：植入15
l细胞
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第四届中华骨科杂志论坛天津·2012
悬液(3×105BMSC)-q10lJl
u
植入15
1
植入5u1细胞悬液(3×105BDNF—MSC)与lOuPRP支架，3只大鼠用来测BDNF在体内的表达。各
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