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第七次全国环境徽生物学术研讨会论文摘要 环境微生物群落基因组学研究技术 胡立杰k2李永峰2郑国香2 (1哈尔滨工业大学糖业研究院，哈尔滨，150086；2哈尔滨工业大学市政 环境工程学院，哈尔滨150090) 0前言 目前，大多数对微生物鉴定的研究都是在实验室中采用纯培养技术进行 的。这种研究对于微生物学科的发展和了解微生物的基础十分有意义。然而， 在最近环境群体微生物研究文献中涉及到的有关微生物种群及其内部联系的内 容中并没有提到纯培养技术．事实上，大多数存在于复杂群落中的野生型细 菌，从前都没有在实验室中被培养和驯化过的，我们该如何获得一个更准确的 对于自然微生物生态系统的结果和功能起重要作用的细菌和过程的描述呢?一 些最早提出通过研究自然菌群来进行培养，他们的实验构想涉及到对核酸水平 上的克隆和测序技术的应用，以其获得野生型菌的多样性．这些具有巨大影响 的构想引出当今普遍使用的，从混合微生物聚集体中克隆rRNA的实验，从而 达到确定群体组成的系统发育地位．在过去的十年中，这种非培养的分子系统 发育调查得到了一个男人吃惊的新的系统发育体系，从纯培养研究的角度讲完 全出人意料的生态优势细 菌和古细菌。我们目前已 经大大地加深了对野生菌 多样性在范围和性质方面 的了解，这应归功于非培 养rRNA调查的应用。过 去十年，我们看到基因组 节旦世亩 测序在飞速发展．自第一 革哗ih 勺蠢目J上莲 株完整的细菌基因组序列 被测出后，在短短几年 里，得到成百上千的细菌 圈 基因组全序列是完全有希 1 望的。其中有些序列很快 一=三1 2二屯乇奠E。B- 会被确定下来。绝大部分 已测序的基因组序列(大 I 约75％)都来源于重要的 临床微生物．到目前为 o…一～ 止，全部的原核基因组序 圈l自然微生物群体基因组文库制备程序 列。大约90％都来自于细 菌域．大多数基因组的全 序列的获得都归结于纯培 养，尽管有一些是从共生 第七次全国环境微生物学术研讨会论文摘要 或寄生微生物中分离出来的。 1．微生物基因组测序的策略 基因组测序是一个庞大的工程，工作量极大。对于人类基因组，需要先绘 site)为标记 制遗传图、物理图谱，尤其是以STS(sequence-tagged 分段包干，采用很多仪器同时进行测序，再将测序结果整合起来成为基因组的 序列图谱，这是因为真核生物基因组十分巨大而又复杂。序列图谱是基因组计 划要完成的分辩率最高的基因组图谱。对于微生物基因组，通常采用 random (Shotgun 具体操作包括下列7个步骤： 1．1制备基因组DNA 制备高质量基因组DNA，这里所谓高质量是从DNA分子的完整性和纯度 来讲的。然后用超声波将DNA分子随机剪切断长约2kb的片段，并用琼脂糖凝 胶电泳分离纯化2kb左右的片段，用于建立小片段文库。同时，采用不同的超 声条件，再构建一个含大片段(约15～20kb)DNA的文库。 1．2建立大片段和小片段DNA文库 将大片段DNA分别插入测序载体，转染细菌，建立两个独立的DNA文 库；并对文库的质量和容量随机进行鉴定．制造随机文库DNA片段的另一种 方法就是不完全酶切法，用此法可以不同构建大、小两个文库，而只需构建一 个文库即可。 1．3高流通量测序 最大限度随机化地从构建的文库中挑取克隆制备测序模板。使用多台自动 化测序仪进行高流通量测序，每个克隆只需在两端各进行一个测序即可。