玻璃化法超低温保存荔枝胚性悬浮细胞.pdfVIP

132 中国园艺学会热带南亚热带果树分会成立大会暨首届学术研讨会论文集 玻璃化法超低温保存荔枝胚性悬浮细胞 谢玉明12易于军2曾继吾2 张秋明1 广州5106402广东省农业科学院果树研究所1 (1湖南农业大学园艺园林学院，长沙410128， 摘要：本研究以荔枝(Litchichinesis SoRll,)胚性悬浮细胞为材料，首次研究了荔枝胚性悬浮细胞玻璃 化法超低温保存的一些影响因素，通过此项研究，建立了比较适宜于荔枝胚性悬浮细胞的玻璃化法保存方 法：将继代培养3d的胚性悬浮细胞，在含有0．4mol／L山梨醇培养基上预培养2d后，先在室温下用60％的 玻璃化溶液(PVS2)中装载15min，再用PVS2于0℃下处理15～20rain，换一次新鲜的PVS2溶液后。迅速投 入液氮。保存24h后，在40℃水浴中快速化冻．用1．2mol／L的蔗糖培养液洗涤2次，经1-rC检测，相对存 活率达到27。1％。 关键词：荔枝，胚性悬浮细胞，超低温保存，玻璃化法 树11]。它是众多难以离体培养成功的果树之一，其难度在于培养时组织易褐变，导致培养失败。目 前。国内外有关荔枝离体培养成功的报道很少，荔枝离体培养技术进展较为缓慢。笔者以荔枝”妃子 笑”品种花药为材料，通过体胚发生途径获得了再生植株翻。通常荔枝胚性愈伤组织比较难以获得。 细胞悬浮培养体系的建立需花费大量精力和较长时间，而且长期的继代培养会导致体细胞变异和植株 再生能力下降。因此，胚性细胞系的建立和用适宜方法的保存细胞系是关系到荔枝细胞遗传操作效率 的两个重要环节。超低温保存是长期保存植物组织和细胞的有效方法。玻璃化法是超低温保存植物材 料的新技术，具有设备简单、操作方便和冻存效果好等优点，成为较理想的植物种质资源保存方 法【31。利用玻璃化冻存法已成功保存了多种植物材料，如茎尖141、愈伤组织【51、原生质体{们、合 子胚叼等。尽管超低温保存技术在多种植物上广泛应用，但国内外尚未在荔枝上开展这方面的研究。 本研究以荔枝胚性悬浮细胞为试材，研究影响荔枝胚性悬浮细胞玻璃化法超低温保存的一些因素，建 立荔枝胚性细胞玻璃化法超低温保存体系。为今后进行荔枝种质资源保存和研究提供原始材料和技术 支持。 1材料与方法 1．1材料 本研究以荔枝品种妃子笑的胚性愈伤组织为试材，来建立胚性悬浮细胞系。将继代培养lOd的胚 性愈伤组织转入与愈伤组织继代培养基成分相同(去琼脂)的液体培养基中，在120r／min的摇床上悬 浮培养。每一个星期继代一次，继代培养6次以后可获得良好的细胞悬浮培养系。 1．2方法 预培养：选处于指数生长期的胚性悬浮细胞。放在0．4mol／L山梨醇的培养液中预培养不同的天 数。 预处理(装载)：把经过预培养后的胚性悬浮细胞转移到1．8ml的冷冻管中，每管约0．29，先在室 温下用60％的玻璃化溶液(PVS：) 时间。 ·广东省农业科学院院长基金项目资助项目(04一基金埘B) for 料通讯作者Author correspondence 中国园艺学会热带南亚热带果树分会成立大会暨首届学术研讨会论文集 133 玻璃化溶液处理(脱水)和冰冻处理：经过以上处理后的胚性愈伤组织，再用PVS：(30％甘油 移去原液。换一次新鲜的PVS2溶液，然后将冷冻管装在金属套上，系上一根细线，每个金属套放两 管．将材料迅速投入到液氮中。各处理2管，重复3次。预培养、预处理和玻璃化溶液处理均为单因 子试验。 解冻处理：保存24h后，从液氮中取出冷冻管，在40℃下迅速化冻约90s，待冷冻管内冰化尽以 后。用含1．2mol／L的蔗糖+MS基本培养基的下载液洗涤两次，每次10min。 tetrazolium chloride，氯化三苯四氮