实验一 蛋白质的颜色反应与沉淀反应.docVIP

实验一 蛋白质的颜色反应与沉淀反应 蛋白质分子中的某种或某些基团与显色剂作用，可产生特定的颜色反应。不同蛋白质所含的氨基酸不完全相同，颜色反应亦可不同。颜色反应不是蛋白质的专一反应，一些非蛋白物质亦可产生相同的颜色反应，因此不能仅根据颜色反应的结果决定被测物质是否是蛋白质。颜色反应是一些常用的蛋白物质的定量测定的依据。 多数蛋白质是亲水胶体，当其稳定因素被破坏或与某些试剂结合成不溶解的盐后，即产生沉淀。 实验材料与仪器 鸡（或鸭）蛋白 吸管0.5 ml（×1）、1ml（×3）、2 ml（×2）、5ml（×2） 滴管 试管1.5×15cm（×10） 水浴锅 电炉 吸滤瓶500ml（1） 布氏漏斗 试剂 1. 卵清蛋白液：将鸡（或鸭）蛋白用蒸馏水稀释20～40倍，2～3层纱布过滤，滤液冷藏备用。 2. 1%苯酚溶液：苯酚1ml，加蒸馏水稀释至100ml。 3. 1%白明胶液：1g白明胶溶于少量热水，完全溶解后稀释至100ml。 4. 米伦（Millon）试剂：40g汞溶于60ml浓硝酸（比重1.42），水浴加温助溶，溶解后加二倍体积蒸馏水，混匀，静置澄清，取上清液备用。此试剂可长期保存。 5. 0.5%茚三酮溶液：0.5g茚三酮溶于95%乙醇并稀释至100ml。 6. 尿素：如颗粒较粗，最好研成细粉末状。 7. 10%NaOH溶液：10gNaOH溶于蒸馏水，稀释至100ml。 8. 浓硝酸：比重1.42 9. 1%硫酸铜溶液：硫酸铜1g溶于蒸馏水，稀释至100ml。 10. 硫酸铵晶体：如颗粒太大，最好研碎。 11. 饱和硫酸铵溶液：蒸馏水100ml，加硫酸铵至饱和。 12. 95%乙醇 13. 结晶氯化钠 14. 2～3%醋酸铅（或AgNO3）：2～3g醋酸铅溶于蒸馏水并稀释至100ml。 15. 5%鞣酸溶液：5g鞣酸溶于蒸馏水并稀释至100ml 16. 饱和苦味酸溶液 17. 1%醋酸溶液：冰醋酸1ml用蒸馏水稀释至100ml。 主要内容 （一）米伦氏反应 1. 用苯酚实验：取1%苯酚溶液1ml于试管中，加米伦氏剂约0.5ml，小心加热溶液即出现玫瑰红色。 2. 用蛋白溶液实验：取2ml蛋白溶液，加入0.5ml米伦试剂，此时出现蛋白质的沉淀。小心加热，凝固之蛋白质出现红色。 3. 用白明胶（也是一种蛋白）做上述实验，结果如何？ （二）双缩尿反应 1. 取少许结晶尿素放在干燥试管中，微火加热，尿素熔化并形成双缩尿，释出之氨可用红色石蕊试纸检测。至试管内有白色固体出现，停止加热，冷却。然后加10%NaOH溶液1ml摇匀，再加2滴1%CuSO4溶液，混匀，观察有无紫色出现。 2. 另取一只试管，加蛋白液10滴，再加10%NaOH溶液10滴及1%CuSO4溶液2滴，混匀，是否出现紫玫瑰色。 注意硫酸铜不能多加，否则产生深蓝色的干扰络离子。 （三）黄色反应 于一试管内，置蛋白溶液10滴及浓硝酸3～4滴，加热，冷却后再加入10%NaOH溶液5滴，观察颜色变化。 （四）茚三酮反应 取1ml蛋白溶液置于试管中，加2滴茚三酮试剂，加热至沸，即有蓝紫色出现。注意此反应必须在pH5～7进行。 （五）蛋白质盐析作用 1.取蛋白质溶液5ml于试管，再加入等量饱和硫酸铵溶液（此时硫酸铵的浓度为50%饱和），微微摇动试管，使溶液混合后静置数分钟，球蛋白即析出（如无沉淀可再加少许饱和硫酸铵）。 2. 将上述混合溶液过滤，滤液中加入硫酸铵粉末，至不再溶解，析出的为清蛋白，再加水稀释，观察沉淀是否溶解。 （六）酒精沉淀蛋白质 取蛋白质溶液1ml，加晶体NaCl少许（加速沉淀并使沉淀完全），待溶解后再加入95%乙醇2ml混匀，观察有无沉淀析出。 （七）重金属沉淀蛋白质 取试管2支各加入蛋白质溶液2ml，一管内滴加2～3%醋酸铅（或AgNO3），另一管内滴加1%硫酸铜溶液至有沉淀析出。 （八）生物碱沉淀蛋白质 取试管2支各加入2ml蛋白质溶液及1%醋酸溶液4～5滴，向一管中加5%鞣酸溶液数滴，另一管中加入饱和苦味酸溶液数滴，观察结果。 实验二 双缩尿法测定蛋白质浓度 具有两个或者两个以上肽键的化合物皆有双缩尿反应。由于蛋白质分子中含有很多与双缩脲结构相似的肽键，因此也能与铜离子在碱性溶液中发生双缩脲反应，且颜色深浅与蛋白质的含量的关系在一定范围内符合比尔定律，而与蛋白质的氨基酸组成及分子量无关，故可用双缩脲法测定蛋白质的含量（借助分光光度计可减小误差）。4·5H2O溶于约15ml蒸馏水，置于100ml容量瓶，加入30ml浓氨水、30ml冰冷的蒸馏水和20ml饱和氢氧化钠溶液，摇匀，室温放置1～2小时，再加蒸馏水至刻度，摇匀备用。 2. 卵清蛋白（或酪蛋