实验二 美拉德反应初始反应阶段的测定.docVIP

实验报告 实验项目编号：实验二 实验名称：美拉德反应初始反应阶段的测定 实验学时：3 实验日期：暂时不写 实验地点：格致楼A415 实验目的 1. 了解美拉德反应的基本原理和测定方法。 二、实验原理 美拉德反应即蛋白质、氨基酸或胺与碳水化合物之间的相互作用。美拉德反应开始，以无紫外吸收的无色溶液为特征。随着反应不断进行，还原力逐渐增强，溶液变成黄色，在近紫外区吸收增大，同时还有少量糖脱水变成5-羟甲基糖醛（HMF），以及发生健断裂形成二羰基化合物和色素的初产物，最后生成类黑精色素。本实验利用模拟实验：即葡萄糖与甘氨酸在一定pH缓冲液中加热反应，一定时间后测定HMF的含量和在波长为285nm处的紫外吸光值。 HMF的测定方法是根据HMF与对一氨基甲苯和巴比妥酸在酸性条件下的呈色反应。此反应常温下生成最大吸收波长的550nm的紫红色。因不受糖的影响，所以可直接测定。这种呈色物对光、氧气不稳定，操作时要注意。 三、实验材料和试剂 (一) 仪器：分光光度计、水浴锅、试管、移液管等。 (二) 试剂 1．巴比妥酸溶液：称取巴比妥酸500 mg，加约70 mL水，在水浴加热使其溶解，冷却后转移入100 mL容量瓶中，定容。 2．对甲基苯氨溶液：称取对甲基苯氨l0.0 g，加50 mL异丙醇在水浴上慢慢加热使之溶解，冷却后移入100 mL容量瓶中，加冰醋酸l0 mL，然后用异丙醇定容。溶液置于暗处保存24小时后使用。保存4-5天后，如呈色度增加，应重新配制。 3. 1.0 mo1/L葡萄糖溶液。 4. 0.1 mol/L甘氨酸溶液。 5. 10%NaOH溶液。 6. 20%亚硫酸钠溶液。 四、实验步骤 (一) 取5支试管，分别加入5 mL 1.0 mo1/L葡萄糖溶液和0.1 mol/L甘氨酸溶液，编号为A1，A2，A3，A4，A5。A2，A4调pH到9.0，A5加亚硫酸钠溶液5 mL。5支试管置于90 ℃水浴锅内并记时，反应1 h，取A1，A2，A5管，冷却后测定它们的285 nm紫外吸收和HMF值。 (二) HMF的测定：A1，A2，A5各取2.0 mL于三支试管中，加对甲基苯氨溶液5 mL。然后分别加入巴比妥酸溶液l mL，另取一支试管加A1液2 mL和5 mL对甲基苯氨溶液，但不加巴比妥酸液而加l mL水，将试管充分振动。试剂的添加要连续进行，在1-2 min内加完，以加水的试管作参比，测定在550 nm处吸光度，通过吸光度比较A1，A2，A5中HMF的含量可看出美拉德反应与哪些因素有关。 (三) A3，A4两试管继续加热反应，直到看出有深颜色为止，记下出现颜色的时间。 五、注意事项 HMF显色后会很快褪色，比色时一定要快。 六、实验结果 （实验报告记录相关数据（见下表）及解释原因）。 A1 A2 A5 A285 nm A1 A1 A2 A5 反应液体积数 2 mL 对甲基苯氨溶液 5 mL 巴比妥酸溶液 0 1 mL 蒸馏水 1 mL 0 A550 nm A3 A4 反应总时间 七、思考题 1. 如何控制美拉德反应？