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发酵工程 种子的扩大培养 2.5种子的扩大培养 2.5.1种子扩大培养的任务 2.5.2种子制备的过程 霉菌、放线菌的种子制备一般包括两个过程，即在固体培养基上生产大量孢子的孢子制备和在液体培养基中生产大量菌丝的种子制备过程。 ⑴ 放线菌孢子的制备 放线菌的孢子培养一般采用琼脂斜面培养基，培养基中含有一些适合产孢子的营养成分，如麸皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些无机盐等。 ⑵ 霉菌孢子的制备 霉菌的孢子培养，一般以大米、小米、玉米、麸皮、麦粒等天然农产品为培养基。这是由于这些农产品中的营养成分较适合霉菌的孢子繁殖，而且这类培养基的表面积较大，可获得大量的孢子。 霉菌的培养一般为25～28 ℃，培养时间为4～14天。 （3）细菌培养物的制备 细菌斜面培养基多采用碳源限量而氮源丰富的配方。 牛肉膏、蛋白胨常用作有机氮源 细菌培养温度的大多数37℃，少数为28℃ 细菌菌体培养时间一般1～2天，产芽孢的细菌则需培养5～10天 ⒉ 种子制备 种子制备是将固体培养基上培养出的孢子或菌体转入到液体培养基中培养，使其繁殖成大量菌丝或菌体的过程。 2.5.3种子培养 种子培养要求一定量的种子，在适宜的培养基中，控制一定的培养条件和培养方法，从而保证种子正常生长。 工业微生物培养法分为静置培养和通气培养两大类型 ⒈ 表面培养法 表面培养法是一种好氧静置培养法。针对容器内培养基物态又分为液态表面培养和固体表面培养。相对于容器内培养基体积而言，表面积越大，越易促进氧气由气液界面向培养基内传递。这种方法菌的生长速度与培养基的深度有关，单位体积的表面积越大，生长速度越快 ⒉ 固体培养法 固体培养又分为浅盘固体培养和深层固体培养，统称为曲法培养。它起源于我国酿造生产特有的传统制曲技术。其最大特点是固体曲的酶活力高。 ⒊ 液体深层培养 液体深层种子罐从罐底部通气，送入的空气由搅拌桨叶分散成微小气泡以促进氧的溶解。这种由罐底部通气搅拌的培养方法，相对于由气液界面靠自然扩散使氧溶解的表面培养法来讲，称为深层培养法。 深层培养基本操作的三个控制点 ① 灭菌 发酵工业要求纯培养，因此在种子培养前必须对培养基进行加热灭菌。 ② 温度控制 ③通气、搅拌 空气进入种子罐前先经过空气过滤器除去杂菌，制成无菌空气，而后由罐底部进入 几种深层培养法 ① 控制培养法 根据罐内部的变化情况，掌握短暂时间内状态变量的变化以及可能测定的环境因子对微生物代谢活动的影响，并以此为基础进行控制培养，以达到产物的最优培养条件。 2.5.4 种子质量的控制 2.5.4.1 影响孢子质量的因素及其控制 ① 供生产用的孢子培养基或作为制备砂土孢子或传代所用的培养基要用比较单一的氮源，以便保持正常菌落类型的优势； ② 作为选种或分离用的平板培养基，则需采用较复杂的有机氮源，目的是便于选择特殊代谢的菌落。 ⒉ 培养温度和湿度 斜面孢子培养时，培养室的相对湿度对孢子形成的速度、数量和质量有很大影响。空气中相对湿度高时，培养基内的水分蒸发少；相对湿度低时，培养基内的水分蒸发多。 一般来说，真菌对湿度要求偏高，而放线菌对湿度要求偏低。 ⒊ 培养时间和冷藏时间 ⑴ 孢子的培养时间 ⒋ 接种量 制备孢子时的接种量要适中，接种量过大或过小均对孢子质量产生影响。因为接种量的大小影响到在一定量培养基中孢子的个体数量的多少，进而影响到菌体的生理状态。 除了以上几个因素需加以控制之外，要获得高质量的孢子，还需要对菌种质量加以控制。 用各种方法保存的菌种每过1年都应进行1次自然分离，从中选出形态、生产性能好的单菌落接种孢子培养基。制备好的斜面孢子，要经过摇瓶发酵试验，合格后才能用于发酵生产。 2.5.4.2 影响种子质量的因素及其控制 种子的质量是发酵能否正常进行的重要因素之一。种子制备不仅是要提供一定数量的菌体，更为重要的是要为发酵生产提供适合发酵、具有一定生理状态的菌体。种子质量的控制，将以此为出发点 ⒈ 培养基 种子培养基的营养成分应适合种子培养的需要，一般选择一些有利于孢子发芽和菌丝生长的培养基，在营养上易于被菌体直接吸收和利用，营养成分要适当地丰富和完全，氮源和维生素含量较高，这样可以使菌丝粗壮并具有较强的活力。 另一方面，培养基的营养成分要尽可能地和发酵培养基接近，以适合发酵的需要，这样的种子一旦移入发酵罐后也能比较容易适应发酵罐的培养条件。 ⒉ 培养条件 种子培养应选择最适温度，前面已有叙述。培养过程中通气搅拌的控制很重要，各级种子罐或者同级种子罐的各个不同时期的需氧量不同，应区别控制，一般前期需氧量较少，后期需氧量较多，应适当增大供氧量。 ⒊ 种龄 种子培养时间称为种龄。 最适种龄因菌种不同而有很大的差异。细菌的种龄一般为7～24