N-酰基高丝氨酸内酯酶基因克隆、表达、性质研究与防治鱼类暴发性流行病应用.pdfVIP

水产动物疾病的成因、流行与控制的理论与实践 试验中测定天津爆发的粘孢子虫样品的18srDNA序列，比对后显示与粘孢子虫纲、双 壳目、碘泡虫属、单极虫Thelohanellushovorkoi具有96％的相似性。用ChiCD3基因在大肠 杆菌中表达的几丁质酶对粘孢子虫孢子处理，进行光镜检测，试验结果显示几丁质酶能够 对粘孢子虫孢子的几丁质壳瓣有侵蚀降解作用。 关键词：粘孢子虫，孢子，几丁质酶，池塘底泥，简并引物 N．酰基高丝氨酸内酯酶基因克隆、表达、性质研究与防治鱼类 暴发性流行病应用 周志刚 (中国农业科学院饲料研究所农业部饲料生物技术重点开放实验室，北京100081) 摘 要：N．酰基高丝氨酸内酯酶是一类特异性降解N．酰基高丝氨酸内酯类信号分子 (AHLs)的金属水解酶，广泛存在于多种微生物中，近年来作为一种新型抗菌策略(群 体感应淬灭策略)的工具酶而成为研究的热点。目前主要是通过构建转基因植物、转基因 细菌研究其在群体感应淬灭中的作用机制，而转基因植物或转基因细菌在实际应用中存在 生物安全和有效性方面的问题。本研究的目的是毕赤酵母高效表达N．酰基高丝氨酸内酯并 将该酶以酶制剂的形式来防治水产养殖中嗜水气单胞菌引起的疾病。 首先以3-oxo．C6．HSL为唯一碳源和氮源的筛选培养基通过富集培养的方法从天津武 rDNA鉴定为苏云金芽胞 清池塘低泥分离出一株产N．酰基高丝氨酸内酯酶的菌株，经16s 杆菌。通过设计该种属N．酰基高丝氨酸内酯酶的兼并引物，成功克隆了N．酰基高丝氨酸 内酯酶基因aimB546，aliaB546片段大小为753bp，编码250个氨基酸，预测编码蛋白的分 子量为28．14 kDa，等电点为4．64，在蛋白的N端预测一个N糖基化位点(Asn．Ser-Thr)。 根癌农杆菌KYC55活性平板法筛选出高效表达的13号菌株。以3-oxo．C8．HSL为底物， U／mL，通过3．7L发酵 在摇瓶水平上该菌株表达的N．酰基高丝氨酸内酯酶酶活为27．1±3．2 罐高密度发酵，重组蛋白的表达量高达3，558．4±81．3U／mL，而大肠杆菌表达的酶活仅为 0．24 U／mL。毕赤酵母明显提高了N．酰基高丝氨酸内酯酶的表达量，实现了目的蛋白的高 效表达。 139 中国首届渔药研制与规范使用专题学术大会暨中国水产学会渔药行业协作网成立大会论文(摘要)集 毕赤酵母表达的重组蛋白通过硫酸铵沉淀和阴离子柱纯化出33．6kDa的单一条带。经 质谱鉴定为目的蛋白，Endo H处理验证了N糖基化的存在。纯化AiiA的最适pH和温度 分别为8．0和20℃，在pH6．5．8．5范围内，酶活性均能维持在80％以上，在0*C，2012～37℃， Ai认具有60％的酶活力。Ai认具有良好的pH和温度稳定性。在pH6．5．12．0范围内处理 60min后，酶活性均高于100％，说明Ai认在中性和碱性条件下非常稳定。AiiA在60C 保温60min，酶活性基本维持不变，70℃保温15min，剩余90％以上的酶活，说明Ai认在 60℃和70C条件下仍非常稳定。Ai认具有非常好的抗胰蛋白酶，a一糜蛋白酶，枯草杆菌蛋 白酶，胶原蛋白酶，碱性蛋白酶的能力，AiiA与上述蛋白酶共处理60min，Ai认的酶活性 均大于100％。此外，大多数离子对Ai认无抑制作用。 AiiA和嗜水气单胞菌共注射锦鲤可以明显降低嗜水气单胞菌致死锦鲤的平均累积死 亡率为25％，延迟了锦鲤的半数致死时间为18h。单独注射锦鲤AiiA，经长时间观察锦鲤 生存状态良好。根据实验结果预测AiiA对鱼体无害并且可以降低嗜水气单胞菌致死能力， 本实验为潜在机制的研究提供了重要的实验数据。 本实验不仅在毕赤酵母中成功高效表达了Ai认，低成本获得大量的AiiA成为可能， 而且以酶制剂的形式通过活体注射的方式成功衰减嗜水气单胞菌在锦鲤中的致死能力。根 据所知，这是首次在毕赤酵母中高