实验一氨基酸的分离鉴定——纸层析法.pptVIP

实 验 一 氨基酸的分离鉴定——纸层析法 一、实验目的 掌握氨基酸纸层析的方法和原理，学会分析待测样品的氨基酸成分。 二、实验原理 纸层析是以滤纸为惰性支持物的分配层析。滤纸纤维上的羟基具有亲水性，吸附一层水作为固定相，有机溶剂为流动相。当有机相流经固定相时，物质在两相间不断分配而得到分离。 溶质在滤纸上的移动速度用Rf值表示： Rf=原点到层析斑点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离 在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。本实验利用纸层析法分离氨基酸。 三、实验器材 1、大烧杯（5000mL）：1只/组。 2、微量注射器（100μL）：1支/组。 3、培养皿：1个/组。 4、层析滤纸（长22cm、宽14cm的新华一号滤 纸）：1张/组。 5、直尺、铅笔：自备。 6、电吹风：1个/组。 7、白线：1条/4组。 8、小烧杯：50mL，1只/组。 四、实验试剂和材料 1、扩展剂：将4体积正丁醇和1体积冰醋酸放 入分液漏斗中，与5体积水混合，充分振 荡，静置后分层，弃去下层水层。 2、氨基酸溶液：0.5%的已知氨基酸溶液3种 （组氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸），0.5%的待 测氨基酸溶液1种（组氨酸、苯丙氨酸、甘 氨酸） 。 3、显色剂：0.1%水合茚三酮正丁醇溶液。 五、实验操作 1、层析滤纸的制作：取宽约15cm、高15cm的层析滤纸一张。在纸的下端距边缘2cm处轻轻用铅笔画一条平行于底边的直线A，在直线上做4个记号，记号之间间隔2cm，这就是原点的位置。 2、点样：用微量注射器分别取10μL左右的氨基酸样品（每取一个样之前都要用蒸馏水洗涤微量注射器，以免交叉污染），点在这四个位置上。挤一滴点一次，同一位置上需点2～3次，2～3μL/次。每点完一点，立刻用电吹风热风吹干后再点，以保证每点在纸上扩散的直径最大不超过3mm。每组须点4个样，其中3个是已知样，1个是待测样品。 3、缝合：将滤纸缝成筒状，纸的两侧边缘不能接触且要保持平行。 4、层析：将点好样的滤纸筒直立于培养皿中（点样的一端在下，扩展剂的液面在A线下1cm），两组合用一个层析缸，最好两组一起放入，且不要互相接触，或与缸壁接触。 5、显色：当扩展剂上升到离纸上端1——2cm时，取出滤纸，剪断连线，立即用铅笔描出溶剂前沿线，迅速用电吹风热风吹干。即可显出各层析斑点。 6、计算Rf值，并判断混合样品中都有哪些氨基酸，各人将自己的实验结果贴在实验报告上 七、注意事项 1、在实验之前，必须洗干净手，再接触滤纸。 2、点样之前，从微量注射器中挤出液滴时，要移到滤 纸范围以外，避免溅到滤纸上，造成污染。 3、点样时应坐姿端正，手臂手腕紧靠桌面，以保持稳定性。 4、滤纸标记必须使用铅笔而不能使用圆珠笔等油性笔。 5、使用微量注射器时，注意针头的朝向，切勿伤及自 己和他人。 6、电吹风使用后切勿压在其电源线上，以免烫化胶皮 引起短路。 7、在缝滤纸筒时要避免纸的边缘完全接触，要保持滤 纸两个边缘平等。 思 考题 1、用手直接接触滤纸会引起什么不良后果， 为什么？ 2、请查阅什么是“塔板理论”，并用其解释纸层 析分离氨基酸的原理。 3、为避免实验结果出现“拖尾”现象，实验操作 中应注意哪些环节？ 4、标记滤纸时不能使用油性笔，为什么？ * * *