成纤维细胞生长因子信号分子的结构和功能.docVIP

成纤维细胞生长因子信号分子的结构和功能庞大的FGFs家族成员是对多种细胞显示多样生理和(或)药理作用的多能信号分子〔2〕 。随着FGFs基因组工程的完成和蛋白组工程（结构、功能和作用机制）的研究深入，作为细胞增殖因子、血管形成因子、神经营养因子、形态发生因子、组织修复-再生因 子的FGFs，有望在发育学、生理学和临床药理学方面作出贡献CN1440982A 公开(公告)日 2003.09.10 申请(专利)号 C3 申请日期 2002.02.27 专利名称 动物乳腺内表达成纤维细胞生长因子（FGF)的重组DNA的构建方法 主分类号 C07K14/50 分类号 C07K14/50;C12N15/09 分案原申请号 优先权 申请(专利权)人 黄伟民 发明(设计)人 黄伟民;温汉平 地址 510075广东省广州市广州大道北542号白云区军休所11栋602号 颁证日 国际申请 进入国家日期 专利代理机构 代理人 国省代码 广东;44 主权项 一种用分子生物学技术构建重组DNA以在动物乳汁中获得成纤维细胞生长因子的方法，其特征是将包含有动物乳蛋白基因启动子和/或增强子的DNA片段与成纤维细胞生长因子DNA的完整或不完整片段直接或间接相连，经过一些必要的修饰后装入适当的DNA载体，构成重组DNA，以此重组DNA配合乳腺导管内注射或其它建立生物反应器的方法，在乳汁中获得活性成纤维细胞生长因子。 摘要 本发明涉及一种用分子生物学技术在乳汁中获得成纤维细胞生长因子的方法，克服了用现有技术提取或人工生产成纤维细胞生长因子之技术难度大、成本高、产量低等不足，将包含有动物乳蛋白基因启动子和/或增强子的DNA片段与成纤维细胞生长因子DNA的完整或不完整片段直接或通过T7RNA聚合酶与T7启动子偶连系统等方法间接相连，经过一些必要的修饰后装入适当的DNA载体，构成重组DNA，经过克隆筛选、扩增、纯化之后，与脂质体等物质混合，然后直接注入动物的乳腺导管内，让重组DNA进入乳腺分泌细胞，或用常规的建立生物反应器的方法建立乳腺定位表达生物反应器，在分泌细胞分泌乳汁时，重组DNA得以表达，用常规的方法挤得乳汁，可从乳汁中获重组DNA的表达产物——成纤维细胞生长因子，本方法具有方法简单、成本低、成纤维细胞生长因子活性高、产量高等优点。 抗菌肽和人酸性成纤维细胞生长因子融合蛋白在毕赤酵母中的表达及其活性鉴定 目的:构建和表达一种抗菌肽和人酸性成纤维细胞生长因子的融合蛋白,在创伤皮肤表面应用时能裂解成有功能的抗菌肽和人酸性成纤维细胞生长因子,预防伤口感染和促进皮肤修复.方法:利用PCR技术分别扩增出带有凝血酶切割位点的天蚕素杂合肽基因和人酸性成纤维细胞生长因子基因.再将两者作为模板,用PCR方法扩增出编码融合蛋白的DNA.将该DNA片段插入到载体pPICZαA中,并利用电转法将质粒转入毕赤酵母smd1168中,Zeocin抗性筛选重组转化子.甲醇诱导96 h,SDS电泳检测融合蛋白的表达,并用Western-blot杂交检测融合蛋白的免疫原性.利用肝素亲和层析纯化融合蛋白,同时检测融合蛋白的抑菌和促3T3Bal/b细胞分裂活性.结果:筛选出能表达相对分子质量约为19 kD融合蛋白的重组转化株,SDS电泳检测显示甲醇诱导96 h后,融合蛋白表达量达到最高,且能与人酸性成纤维细胞生长因子抗体产生免疫反应.融合蛋白没有抑菌活性,而裂解产物则具有抑菌活性.此外,融合蛋白的促细胞分裂活性与野生型人酸性成纤维细胞生长因子相比没有明显的降低.结论:获得含凝血酶切割位点的抗菌肽和人酸性成纤维细胞生长因子的融合蛋白,并在毕赤酵母中实现了表达.融合蛋白的裂解产物具有抑菌活性. 韩兵 陈伟 付小兵 ??解放军总医院第一附属医院全军创伤修复重点实验室 北京市100037 摘要：目的：构建人成纤维细胞生长因子7的重组原核表达质粒pGEX-4T-3-FGF7,并诱导其基因在大肠杆菌DH5α中大量表达,纯化蛋白并检验生物学活性。方法：实验于2006-12在本实验室完成。采用逆转录-聚合酶链反应技术,从人皮肤成纤维细胞内扩增编码人成纤维细胞生长因子7的cDNA序列,以DNA重组技术将获得的目的基因片段连接至原核表达载体pGEX-4T-3上,经抗生素筛选挑取阳性克隆扩增后,提取DNA进行酶切鉴定和测序。同时应用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白免疫印迹方法对其表达产物进行特异性鉴定。超滤纯化蛋白后以四甲基偶氮唑盐法测定其在不同浓度作用下对人表皮角化细胞系生长的影响。结果：克隆出的成纤