共表达HIV-1外膜蛋白和白细胞介素2重组鸡痘病毒的构建及其免疫原性.pdfVIP

中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会成立20周年庆典暨第十次学术研讨会论文集 共表达…V-1外膜蛋白与白细胞介素2重组鸡痘病毒的 构建及其免疫原性 江丈正，金宁一，李子键’， 张立树，张洪勇，尹革芬 1 3002 (解放军军需大学全军基因工程重点实验室，吉林长春 30062；1吉林大学第一医院，吉林长春，13) 以及对巨噬细胞和脑组织纤维特异性识别的区，与HIV一1可诱导中和抗体应答、特异性细胞毒反应及分 和治疗提供了新的途径。现已证明，多数细胞因子具有良好的免疫佐剂性能，对免疫应答具有刺激作 用。本研究拟利用我国鸡痘病毒疫苗株为载体，构建可共表达HIV一1 毒载体，并进行了小鼠的实验免疫研究，为开发HIV重组病毒载体疫苗提供一种安全的新途径。 1材料和方法 1．1材料：大肠杆菌DH5a、含HIV一1 gpl20的重组鸡痘病 所实验动物中心。鸡痘病毒FPV282E4株为南京兽药厂生产的疫苗。表达HIV—l 毒为本室构建。各种工具酶分别购自TaKaRa分司和Gibco mAb由本室制备。地高辛标记试剂盒购自Roche公司。 公司产品。抗HIV一1gPl20 1．2方法 HindIII和Sa／I酶切位点中，构建了中间质粒pUTAL—IL2。再用BamH gpl20，回收gpl20基因并补平，与用Sma 涂布Amp+平板进行培养，待长出菌落后进行鉴定，筛选阳性重组质粒pUTA—GP一1L2。 80％融合的CEF细胞(Chickenembryo 明书介绍的方法转染CEF细胞，然后将转染的CEF细胞培养板置37℃50ml／LC02培养箱中进行培 养，待出现细胞病变后收获病毒。 定。 并。进行重组病毒的核酸杂交检测。(2)Westem blot检测。检 种CEF细胞，待出现细胞病变后收集细胞，以细胞裂解物进行SDS—PAGE和Western mAb和抗IL一2mAb，二抗为碱性磷酸酶标 测HIV一1gpl20和IL一2时，一抗分别为抗HIV一1gpl20 中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会成立20周年庆典暨第十次学术研讨会论文集 记兔抗鼠IgG，用NBT／BCIP显色后观察。 PFu／只，第2组 18—209，随机分成三组，分别采取足垫皮下注射方式，第1组注射FPV对照5X106 注射表达HIV一1gpl20的vUTAL—GP重组病毒5×106 gpl20和hIL一2的vUTAL—GP—IL2重组鸡痘病毒5×106PFU／只。上述各组均免疫3次，每次免疫间 隔为20天，最后一次免疫后的第10天摘眼球取血，凝血分离血清进行ELISA检测。 方法进行。 2结果 I和EcoRI单酶切后， 2．1重组质粒pUTA—GP—IL2的鉴定：重组质粒pUTA—GP—IL2分别经B星n2H 可见0．6kb、0．8kb、i．4kb、1．6kb及5．1kb 正确。 2．2重组病毒的核酸探针杂交检测：用地高辛标记的HIV-1gpl20基因作为探针，用提取的病毒基因组 点膜，按操作说明书介绍的方法进行核酸探针杂交试验。阳性重组病毒基因组点膜处可见一显色斑点， 而阴性重组病毒基因组点膜处未见显色斑点。 2．3表达产物的Western 别与抗gpl20 样的方法也证明，重组病毒同时可表达IL一2。 2．4小鼠血清抗体的测定结果：用双抗原夹心法枪测小鼠血清中抗HIV抗体的检测结果见表1。结果表 毒可诱导小鼠产生抗HIV一1特异性抗体，且人自细胞介素2发挥了细胞因子免疫佐剂的作用。 表l重组病毒免疫鼠血清HIV～1特异的IgG抗々鬯变化