弓形虫SAGⅠ基因的克隆和原核表达.pdfVIP

中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第五次代表大会譬第八次学术研讨会论文集 原虫部分 弓形虫SAGI基因的克隆与原核表达 王金苹1’2赵俊龙“。3江涛“2周艳琴2姚宝安2刘琴“2付媛“2 3007 (1、华中农业大学农业微生物学国家重点实验室湖北武汉4 0) 30070) (2、华中农业大学动物医学院湖北武汉4 摘要：弓形虫病是由弓形虫寄生于人和多种动物细胞内引起的一种严重的人畜共患病。SAG I作为日形虫速殖子的主要表面抗原，能刺激机体产生高效价的抗体，是公认的疫苗后选分子。 本研究利用PCR技术从日形虫RH株基因组中扩增出SAGI部分基因片段，亚克隆入表达载体 白的分子量为57KD。免疫印迹分析显示此表达产物能被猪抗日形虫阳性血清所识别，表明该重组 蛋白具有免疫活性。这为进一步进行日形虫病的免疫预防和诊断研究打下了基础。 关键词：弓形虫，SAGI基因，基因表达 弓形虫病是一种由弓形虫引起的人畜共患病。弓形虫病的传播与流行给畜牧业生产带来很大 损失，尤其对养猪业的危害更大。上世纪60年代末，我国许多省、市发生大批“无名高热猪”， 病因未明。吴硕显等(1977年)从病猪中分离出了弓形虫，证实所谓“无名高热猪”病系弓形虫所 引起。猪弓形虫病是猪发生流产和死胎的原因之一，己证实弓形虫能够通过胎盘、子宫、产道及 初乳等途径传播。该病多在3～4月龄的仔猪中发生，死亡率高达30％～40％，其中以乳猪死亡率 最高“3。国内外猪弓形虫病的发生和血清流行病学调查资料统计结果表明，弓形虫病对猪的感染 是广泛的，其危害也是严重的。 弓形虫SAGI是速殖子的主要特异性抗原，占速殖子全部抗原的5％。而且在各种虫株间具有 很强的保守性，它可作为保护性抗原应用于抗弓形虫病的各类疫苗中”1。Burg于1988年报道了弓 形虫编码SAGI基因序列，为体外重组SAGI奠定了基础。本研究我们设计并合成了编码弓形虫 SAG I部分基因序列的引物，扩增了弓形虫SAGI部分基因片段。将此片段在大肠杆菌(E．coli) 中进行了表达，并对表达产物的抗原活性作了初步分析。 1．材料和方法： 1．1．材料： 1．1．1虫株：弓形虫RH株由湖北省预防医学科学院赠送。 I购 1．1．2试剂：PCR扩增试剂购自宝生物工程(大连)有限公司。限制性内切酶EcoRI、Sal 自船I Biotech晶美生物工程有限公司。琼脂糖， 州兽医研究所。羊抗猪HRP标记第二抗体购自Southern 聚丙烯酰胺等其他化学试剂为国产分析纯。 1．1．3质粒，菌株：E．coliDH5 有限公司，表达质粒PGEX-KG由本室保存。 hzau．eduell 3通讯作者：Email，zhaojunlong@mail 2O6 中匿畜牧鲁医学会家畜寄生虫学分会第五次代表大会暨第八次学术研讨会论文集 原虫部分 1．2方法： 1．2．1弓形虫SAG I基因的引物设计与合成：根据已发表的弓形虫SAGI基因序列。1，设计合成 一对引物，两条引物5端分别引入EcoRI和Sal I的酶切位点，此对引物扩增片段大小为978bp， 由北京奥科生物技术有限公司合成，其序列为： P1：5-GCGAATTCGCATGTTTCCGAAGGCAGT一3 P2：5一GTGTCGACTCACGC GACACAAGCTGCG一3 弃上清，再加150pi 心lOmin，沉淀用70％乙醇洗一次，自然干，用20“lulddHz0溶解，一20℃保存。 裂解buffer：0．1MTris—HcL(Ph8．0)，1％SDS，0．1MNacl，10mMEDTA