丹参不同种质资源AFLP指纹系谱分析和其应用.pdfVIP

开参不同种质资源AFLP指纹系谱分析及其应用 温春秀，吴志明，田伟，刘铭，周巧梅，谢晓亮* (河北省农林科学院经济作物所药用植物研究中心，050051) 丹参Salviamiltiorrhiza Bge．为唇形科鼠尾草属多年生草奉药用植物，在我国大部分地 区均有分布。由于产地生态环境的变化，丹参的植物形态发生了较大变异，如叶形、叶色、 产量和质量等。因此，种质鉴定和选择成为非常迫切的问题。无法以地理渊源和表型差异来 评价它们之问的亲缘关系。为此有必要对更广泛的丹参产地进行采样并采用DNA指纹技术 对丹参进行较全而的遗传分析，以便为丹参的选育提供基础资料。 AFLP(Amplifiedfragmentlength 己被广泛用于种质资源遗传多样性研究、作物品种鉴定、连续图谱构建等研究。其特异分辨 率高，与RAPD等相比，一次扩增可获得更高的位点多态性。尚未见到这种新方法应用于 丹参种质资源研究的报道。本研究应用AFLP技术对不同种质丹参进行分析，可为丹参的 遗传育种研究提供理论依据．为丹参的种质资源鉴定、育种亲本选配等提供快速、有效的分 析方法。 1材料和方法 (1)试验材料 采自河北省农林科学院药用植物中心丹参种质资源圃，实验所用材料为新鲜嫩叶0．2克； 采自15个类型，分别来源于河北、山东、河南、四川、甘肃等地。河北种质编号包括c1、 质编号为C7。AFLP分子标记试剂盒购自鼎国生物技术有限公司。 (2)方法 ①丹参DNA提取 采用cTAB法进行丹参植物总DNA的提取。 @AFLP分析 I／]VIse 采用EeoR I酶切组合进行试验，接头、引物序列以及试验方案按照鼎国公司 AFLP试剂盒的技术说明书进行。总DNA以EcoRI和MseI双酶切，然后加入EeoRI和 Mse GTA I接头和T4DNA连接酶16C连接过夜，其中所用的EcoRI接头为：5，--CTC GACTGCGTACC一3，，MseI接头为：5，--GACGATGAGTCCTGAG一3’。酶切连 接产物用稀释10倍后用于AFLP预扩增反应模板，预扩增的引物为EcoRl预扩引物序列： GTACCAATT GAGTCC E1；5’一GACTGC CA--3’，MseI预扩引物序列：5’一GAT TGAGTAA rain，56℃1rain，72℃1min； C一3，。扩增反应条件：94℃4rain；94℃1 26个循环后。72C再延伸10min。预扩增产物稀释20倍后用于选择性扩增的模板。 选择性扩增引物序列为EcoRI和MseI的核心引物序列加上3个选择性碱基。采用的 I／Mse 引物组合为EcoR I引物组合(表1)。扩增反应条件：第一轮扩增参数；94℃30S． 65C 30S，72℃80S；以后每轮循环温度递减0．7℃，扩增12轮；．接着按下列参数扩增23 轮：94℃30’，55℃30S，72℃80S 表l用于丹参种质资源AFLP分折的选择性扩增的引物序列对 ⑦6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和数据分析 u u 选择性扩增产物取1 L加入12 ROX内标，混合94℃4 L甲酰胺，o．4MIgs．500 rain，迅速冰上放置4min。上样，胶为6％变性聚丙烯酰胺凝胶，在ABl377测序仪上进行 片段扫描。 将电泳图谱的同一位置上的条带视为一个性状，有条带记为”1”。无条带记为“0”。数据 分析用GeneScan和GenotyperT”软件分析处理，峰值大于200的50．500 bp之间条带记为 2．1软件分析计算Nei-Li遗传距离和相似系数，聚