cDNA末端快速扩增技术和其改良.pdfVIP

cDNA末端快速扩增技术及其改良 黄彩红 杨谦 哈尔滨工业大学 生命科学与工程系 哈尔滨 150001 摘要:功能基因组学的开展为基因结构、功能及其表达产物特性的研究提出了 更高要求，完整的基因信息是必需的，因此基因全长的克隆成为研究基因功能 的首要前提，cDNA末端快速扩增技术是基于PCR技术的一种快速获得cDNA 的5‘和3‘末端的方法，本文从RACE技术的原理出发，阐述RACE技术及 其改良，对微生物功能基因组研究有所借鉴。 关键词:RACE;全长:cDNA;改良 全长 cDNA 的克隆是目前人类基因组研究中的一个重要方面，与大规 模基因组测序相比较，cDNA测序克隆用相对较少费用获得更多的功能基因 信息而成为基因组研究的主要方向。构建和筛选 cDNA文库、硅片克隆及 基于PCR的克隆技术是当前分离和克隆目的基因的常用方法，比较而言， 前两者具有实验周期长、技术步骤烦琐且工作量大等特点，而基于PCR的 克隆技术相对具有简单、快速、廉价等优势而得到更为广泛的应用。 Mullis等在1983年发明的PCR技术早己成为分子生物学及其相关领域 的经典实验方法，目前许多cDNA基因克隆方法是基于PCR及其衍生技术 并在cDNA文库的构建、EST的分离、cDNA基因克隆、新基因的分离、基 因表达的检测分析等研究领域中发挥着重要的作用。这些技术包括RTPCR, 锚定PCR,DD-PCR,DDRTPCR,RAD,SSHI1)、反向PCR、锅柄PCR, 连接介导PPCcRR12,31,RACE等等。近年来，RACE技术作为一种从低丰度的 转录本中快速扩增 cDNA5‘和 3‘末端的技术发展迅速，本文就此技术的 研究进展及改良作以简单介绍。 1.RACE技术的原理 1988年由Frohmanetal发明获得cDNA5‘和3‘末端的方法，也被称 为锚定PCR(Anchored-PCR)或单边PCR(One-sidedPCR)E41。它是利用 Oligo(dT)对mRNA进行反转录的同时在两头加上通用接头(引物)，从而可 利用基因特异的引物((genespecificprimer,GSP)通过PCR反应快速获得目的 序列的5‘端和3’端。 2.RACE技术存在的问题 RACE技术从理论上讲是很简单的，然而在实际操作中会面临很多技术 上的问题，甚至经常会得到错误的扩增和克隆结果。一般有以下两个原因导 致:在5RACE中有3个连续的酶反应(反转录，TdT加尾和PCR扩增)， 每一步都可能导致失败;即使酶反应顺利，也常产生大量的非特异或截短的 产物背景[[5,6]。因此，许多研究者围绕着反转录PCR(RTPCR)和加尾反应这 两个关键步骤对RACE技术进行改良和优化。 3.RACE技术的改良 3.1SLIC-PCR法[,1 SLIC-PCR即单链cDNA末端的单链连接PCR(Singlestrandligationto ss-CdnaendsPCR)对RACE技术中的加尾反应进行了改良。通常，一个序列 很容易加到5‘末端作为反转录的引物，与特异引物或带有poly(dT)尾的寡 聚核昔酸配合，利用大多数mRNA3’末端的poly(A)序列进行扩增。这一方 法在克隆少量mRNA的5‘末端和从少量RNA中建立cDNA文库方面非常 有效，而且它还克服了大部分其它cDNA3‘末端方法的缺陷。 3.2LA-PCR法1Sl LA-PCR法即连接锚定PCR(ligation-anchoredPCR)，是AnthongB. Troutt等人(1992)对RACE加尾反应进行的改良。LA-PCR过程避免了TdT 加尾，在 cDNA上直接连上锚头，减少了特异性受限制的含同聚物引物的 使用，并且不需要进行两轮PCR.LA-PCR只包含3个简单的酶反应，而且 其间不需要对产物进行纯化，具有高效便捷的优点。 3.3RLM-RACE法9() RLM-RACE法即RNA连接酶介导的cDNA末端扩增(RNAligase mediatedamplificationofcDNAends)，是针对截短cDNA的产生而进行的改 良，可得到特异的、确定的DNA片段。RLM-RACE与经典RACE的不同 之处在于其锚定引物在反转录前就连接到mRNA的5‘端，即先用烟草酸 性焦磷酸酶(tabaccoacidpyrophosphatase,TAP)处理全