高速逆流色谱技术在环孢菌素A质量研究应用.pdfVIP

高速逆流色谱技术在环孢菌素A质量研究中的应用 温耀明1，2 陈秀明10陈振伟3方东升1’2郑卫1，2 (1福建省微生物研究所，福州350007； 2福建省新药(微生物)筛选重点实验室，福州350007； 3淄博市沂源县人民医院， 淄博256100；) 摘要探讨高速逆流色谱对环孢菌素A原料药质量研究即有机杂质的分离制备方面 的应用。对两份环孢菌素粗品进行直接高速逆流色谱分离，得到杂质组份环孢菌素B、C、D 和H。应用大孔吸附树脂柱层析与高速逆流色谱相结合的方法，对两份环孢菌素A结晶母液 中的两个未知杂质组分进行大孔吸附树脂柱富集后进行高速逆流色谱分离，得到两个杂质组 分，一个与环孢菌素L同质，初步判断另一个组分可能为环孢菌素E。实验表明，高速逆流 色谱法能对环孢菌素A的有机杂质进行有效分离制备。这些有机杂质的制备有助于环孢菌素 A的质量监控，为实现环孢菌素A原料药生产的安全性、有效性和质量可控性提供了科学有 效的保障。 关键词高速逆流色谱；环孢菌素；大孔吸附树脂；分离 目前，我国原料药要进入美国市场需要美国食品与药物管理局(FDA)认证，进入欧洲市 场则需要欧洲药典委员会(EDQM)审评颁发的“欧洲药典适应性证书”(COS)。其中杂质研究 Q3A(新药原料药杂质研究指导原则)中要求， 及控制是这两个认证的重要部分。根据ICH 提交的文件中需包括有效的分析方法对杂质含量进行检测、规范杂质限度和进行杂质界定 等。对于化学合成的新原料药则明确规定对实际存在的表观量大于或等于0．1％的有机杂质 结构特征进行描述。所以，在原料药的研究开发中，对有机杂质进行分离制备是非常有必要 的，以期获得杂质样品可作为杂质标准品用于原料药有关物质的检测；杂质样品进行结构鉴 定和毒理、药理等考察后提高产品质量和安全性。 环孢菌素是瑞士山道士公司于上世纪七十年代发现的由真菌产生的一组环状十一肽物 质，其中环孢菌素A(CsA)已作为免疫抑制剂广泛应用于器官移植时的抗排斥反应。此后福 建省微生物研究所率先从国内土壤中筛选到不同于山道士公司的环孢菌素产生菌一茄病镰刀 菌，成功开发上市了环孢菌素A，并在1997获得美国食品与药物管理局(FDA)认证。对该原 料药杂质进行研究发现，其主要杂质是发酵同时产生的环孢菌素A的同系物。我所采用传统 的柱色谱从茄病镰刀菌的代谢产物中先后分离出环孢菌素A的同系物一环孢菌素B、C、D和H 等组分。 Counter-current 高速逆流色谱(HighSpeed 效的液一液分配色谱分离技术。该技术由于不需要固体支撑体，因而避免了因不可逆吸附引 起的样品损失、失活和变性等。其次，它的分离效率高，并且分离时间短，一般几个小时 即可完成一次分离；此外，有广泛的液一液分配体系可供选择，体系更换方便、快捷。目前 已广泛应用于生物医药、天然产物、食品和化妆品等领域。在多种结构类型抗生素的分离 纯化方面也得到成功的运用。环孢菌素的分离纯化多采用传统的硅胶、葡聚糖凝胶色谱和 高效液相(HPLC)方法，由于具有不可逆吸附等缺点，收率不高，且分离过程复杂、时间长。 笔者采用高速逆流色谱或结合大孔吸附树脂柱层析的方法对环孢菌素A的有机杂质即同系 物的分离制备进行了一系列研究。 对含环孢菌素A、B、C、D的粗品，我们采用高速逆流色谱直接进行分离。以石油醚／ 丙酮／水(3：3：2v／v)为两相系统，上相为固定相，下相为流动相。进样200毫克，用流动 138 相以2ml／min的流速洗脱，在8个小时内完成分离，得到了纯度大于98％的环孢菌素A、B、C、 D各同系物单体，收率均高于85％，实现了比硅胶柱色谱更快捷，比高效液相更为有效的 制各分离和提纯。 环孢菌素A和H互为异构体，化学结构很相似，只是第十一位上的甲基缬氨酸(MeVal) 的构型不同，在环孢菌素A中为L构型，在环孢菌素H中为D构型(Fig．1)。环孢菌素H的分 离如采用硅胶色谱分离需重复进行，过程复杂。我们在高速逆流色谱成功分离环孢菌素A、 B、C、D同系物的基础上，采用相同的溶剂体系，减少进样量(100mg)，降低洗脱速度 菌素A和H，纯度高于97％，收率为91％和76％。 对于含量较低的其他环孢菌素杂质组