血红蛋白测定方法.docVIP

6.1 血红蛋白测定（氰化高铁法）　　消光系数法和标准曲线法任选其一测定血红蛋白。 １.6.1.1 光系数法１.6.1.1.1 原理血红蛋白(haemoglobin，Hb)被铁氰化钾氧化后生成高铁血红蛋白，再生氰离子结合形成氰化高铁血红蛋白（红色），氰化高铁血红蛋白（红色）极为稳定，在540nm波长下，毫克分子消光系数为44，据此，用分光光度法测其光密度，运用消光系数作血红蛋白的定量测定。１.6.1.1.2 仪器721型或其它型号的分光光度比色计。10微升量吸管。１.6.1.1.3 试剂称取碳酸氢纳（ ）140毫克\铁氰化钾200毫克、氰化钾50毫克，用水溶解并稀释到1000毫升。贮存於棕色试剂瓶内，在暗处或冰箱（+4）保存，至少可稳定数月到一年。１.6.1.1.4 实验步骤１.6.1.1.4.1 试剂2.5毫升於5毫升带盖试管中，加入10微升血液，混匀后，放置15分钟。１.6.1.1.4.2 选用0.5厘米光径比色杯，于540nm波长下，以试剂调零点，将所得样品管之光密度乘以73.6，即为血红蛋白之浓度（克%）。计算公式如下： Ct=待测的血红蛋白（克%）浓度。D 540 = 氰化高铁血红蛋白在540nm波长下测出的光密度。HICN251=测 定时血液的稀释倍数（血10微升加入试剂2.5毫升中）44=氰化高铁血红蛋白的毫克分子消光系数0.5=比色杯的光径10000=将（毫克/升）换算成（克%）的数字１.6.1.1.5 注意事项１.6.1.1.5.1 试剂不要放在聚乙烯瓶内，以免因氰离子与其反应而使试剂作用降低。１.6.1.1.5.2 仪器因mM消光系数法完全依靠仪器的吸光度来计算,故此法要求所用的仪器性能要符合要求(如仪器的波长准确与否,以及灵敏度及线性等),否则将直接影响测定的结果。1.6.1.1.5.3仪器在使用前最好以WHO规定的氰化高铁血红蛋白参考液校正后再使用。参考液最好选用ICSH9国际血液学标准化委员会）确定的由RIV（莅国立公共卫生研究院）制定的氰化高铁血红蛋白参考液或上海医学化验所制血的氰化高铁血红蛋白标准液。1.6.1.2 标准曲线法1.6.1.2.1 原理血红蛋白（hemoglobin,Hb）在铁氰化钾和氰化钾的作用下生成极为稳定的氰化高铁血红蛋白（红色），其颜色深浅与血红蛋白的含量成正比。用分光光度计在540nm波长下，测定血红蛋白标准品和参考标准物质的吸光度，制成标准曲线，测得待测样品的吸光度后查标准曲线即可各Hb的浓度。1.6.1.2.2 仪器10ul血色素吸管（或定量毛细管）5毫升或10毫升带盖试管721、722或723型等型号的分光光度计结和力。从中可计算出未饱和铁量及血清运铁蛋白饱和度。1.6.1.2.3 试剂称取碳酸氢纳（ ）140、铁氰化钾２００mg、氰化钾50mg，用蒸馏水溶解并稀释到1000ml贮存于棕色试剂瓶内，保存于４冰箱可稳定至一年。1.6.1.2.４实验步骤吸取2.5ml试剂于５ml带盖试管中，用10ul血色素吸管（或定量毛细管）取大鼠尾血或静脉血10ul放置于已放入试剂的试管中；混匀放置15分钟。选取0.5cm光径比色杯，于540nm波长下，以试剂调节仪器零点，测定各样品管的吸光度，同时测定血红蛋白标准和参考标准物质的吸光度，绘制血红蛋白的标准曲线。查标准曲线可求得待测样品和参考标准物质得血红蛋白含量g/dl或g/l，计算参考物质的回收率。1.6.1.2.5　注意事项1.6.1.2.5.1　不要将试剂放在聚乙烯瓶内，以免因氰离子与其反应而使试剂作用降低。1.6.1.2.5.2　不宜直接使用消光系数方法计算血经红蛋白的含量，因为仪器的波长准确与否仪器的灵敏度和线性等因素均直接影响测定结果。1.6.1.2.5.3　每次测定时，在不同间隔反复测定血红蛋白标准液和参考标准物质（低、中、高３个浓度）。1.6.1.3　数据处理及结果判定实验数据可用方差分析，但需按方差分析的程度先进行方差齐性检验，方差齐，计算Ｆ值，Ｆ值Ｆ0.05，结论：各级均数间差异无显著性；Ｆ值≥Ｆ0.05，Ｐ≤0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。结果判定受试样品组与对照组比较，血红蛋白浓度升高经统计处理差异有显著性，且受试样品组前后升高幅度达到10g/l以上，判定该受试样品有升高血红蛋白作用，动物实验结果阳性。1.6.2 血清运铁蛋白饱和度测定1.6.2.1　原理血清中加入过量的铁，使血清中的运铁蛋白全部与铁结合，达到饱和，过