实验七蔗糖酶的制备和活力测定.pptVIP

实验 七 蔗糖酶和制备和比活力的测定 酵母蔗糖酶的制备 各级分蔗糖酶溶液活性的测定 （包括葡萄糖标准曲线的制备） 3. 各级分蔗糖酶溶液蛋白质含量的测定 4. 各级分蔗糖酶溶液比活力的计算 蔗糖酶制备的原理 酵母中的蔗糖酶以两种形式存在于酵母细胞膜的外侧和内侧，在细胞膜外细胞壁中的,称之为外蔗糖酶，其活力占蔗糖酶活力的大部分，是含有50% 糖成分的糖蛋白。在细胞膜内侧细胞质中的称之为内蔗糖酶，含有少量的糖。两种酶的蛋白质部分均为双亚基，二聚体，两种形式的酶的氨基酸组成不同，外酶每个亚基比内酶多两个氨基酸，Ser和Met，它们的分子量也不同，外酶约为27kDa(或22 kDa，与酵母的来源有关)，内酶约为13.5kDa。 两种酶底物专一性和动力学性质仍十分相似，因此，本实验未区分内酶与外酶，而且由于内酶含量很少，极难提取，本实验采用研磨水抽提，提取纯化的主要是外酶。 蔗糖酶制备的方法 实验方法参看实验指导教材（p76）。 注意级分II同书上有所不同。在第二步进行热处理（50℃，30分钟）后，离心后将上清转移到离心管中，此时取离心管中的上清约1.5ml，放在小离心管中，作为级分II。 乙醇沉淀后的固体蔗糖酶，等量分装在两个1.5ml的离心管中，4℃下保存，做为下两次实验中的酶。 蔗糖酶活性测定原理 蔗糖酶特异性催化非还原糖中的α-呋喃果糖苷键水解,具有相对专一性,能催化蔗糖水解生成D-果糖和D-葡萄糖,也能水解棉子糖生成密二糖和果糖 3,5-二硝基水杨酸与还原糖在强碱性溶液中沸水浴生成棕红色氨基化合物.在540nm处有最大吸收,在一定范围内颜色深浅与还原糖浓度成正比 酶活性单位为,在一定条件下反应5min,每产生1mg葡萄糖所需要的酶量。实际应用是1 ml酶液所产生葡萄糖的量定为1ml酶液的活力。 酶的比活力，每 mg酶蛋白质所具有的酶活力。 酶 活 测 定 取出后经自来水冷却3min，以标准曲线的“0”管调零点，于540nm处测光密度值。以测定管的光密度值减去对照管光密度值，求得的差值从标准曲线上查得相应的葡萄糖含量，并乘以10，即为每 1ml酶溶液的活力。（对照管中酶液最后加入） 蛋白质含量的测定（考马斯亮蓝方法） 对照：0.5ml水+5ml考马斯亮蓝溶液，混匀后室温放置5分钟以上。 样品：将级分I和级分II分别稀释100或者50倍，取稀释后的酶液0.4ml，加入0.1ml水，混匀后加入5ml考马斯亮蓝溶液，混匀后室温放置5分钟以上。 对照作为参比，测定级分I和级分II的A595。 参照以前实验课中的考马斯亮蓝方法中的蛋白质浓度标准曲线，计算出级分I和级分II中蛋白质含量。 公式： y=0.0035x X代表溶液的浓度（mg/ml），Y代表595nm下的吸收值。 实 验 结 果 1、葡萄糖浓度的标准曲线 2、蔗糖酶制备过程中的级分I和级分II中的蔗糖酶的活力。（每 1ml酶溶液的活力） 0.1ml稀释后的酶A540—根据标准曲线计算反应中葡萄糖的产量—稀释的倍数——1ml酶活力 3、蔗糖酶制备过程中1ml 级分I和级分II中蛋白质的含量。 4、比活力的计算： 级分I和级分II中的蔗糖酶的活力 1ml级分I和级分II中蛋白质的含量 5、乙醇沉淀后的固体蔗糖酶（分装两支1.5ml离心管中，4℃保存，备用） 思 考 题 比活力的概念和酶纯化过程中测定比活力的含义。 比较级分I和级分II的比活力，试分析级分II比活力高的原因。 * 葡萄糖标准曲线的制备 加毕混匀，盖上试管帽，于沸水浴（100℃）中准确煮5min，取出用自来水冷却3min，以零号管调零点，于540nm处测定光密度。以葡萄糖含量为横坐标，以光密度为纵坐标画葡萄糖标准曲线图。 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 0.1mol/LNaOH溶液ml 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 二硝基水杨酸溶液ml 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 2.0 pH5.0 0.1M醋酸缓冲液 ml 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0 标准葡萄糖溶液（1mg/ml） ml 5 4 3 2 1 0 管号 试剂 二硝基水杨酸试剂0.5ml 二硝基水杨酸试剂0.5ml 沸水浴煮5min 0.1mol/LNaOH溶液2.5ml 25℃水浴5min 0.10 0.10 稀释X倍以后的酶液ml （级分I和级分II） 0.1mol/LNaOH溶液2.5ml 25℃水浴中保温3min 1.