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λ噬菌体的培养纯化和DNA的提取 λ噬菌体是分子克隆工作中最常用的基因载体之一。λ噬菌体基因组所含DNA是由48，502bp组成的线性双链分子。DNA的两个末端各有一个十二核苷酸长的5′突出单链，而且两单链的碱基顺序是互补的。当噬菌体感染宿主大肠杆菌细胞后，DNA链借其单链粘性末端能使自身环化，并以环状分子的形式在转染的早期进行DNA的复制及转录作用。λDNA的复制可以有两条途径：①DNA在宿主体内环化后即行复制，并合成出大量的噬菌体基因产物和生成无数的子代噬菌体。随着它们的生成和成熟，最终导致宿主细胞的裂解。释放出来的噬菌体又可感染其它宿主细胞。这是噬菌体的裂解生长过程;②另一途径是溶原生长。进入到细胞内的噬菌体基因组被整合到宿主的染色体DNA中，它随着宿主细胞的染色体DNA一起复制和传入宿主的子代细胞中。 对λ噬菌体分子生物学的深入研究，包括λDNA各基因功能的阐明，全部核苷酸序列的测定和基因谱的分析，加上人工包装噬菌体的成功，λDNA作为分子克隆的载体已被广泛使用。目前已从λ噬菌体DNA人工构建成二十余种有用的载体，例如Charon系列载体，EMBL3-4，λgt10，λgt11，λgt18-23系列，λ2001，λDASH，λFix，λZAP，λORF8等载体。大大增加了噬菌体在分子克隆工作中的应用范围。λ噬菌体的纯化和λDNA的制备是现代核酸技术中常用的方法之一。这一节将简单介绍λ噬菌体的感染和裂解生长、纯化，以及噬菌体DNA制备方法。 一、噬菌体的原种制备和培养 要想获得大量的噬菌体，首先得用噬菌体感染宿主细胞。大肠杆菌是λ噬菌体的宿主菌。但是，对于不同的λ噬菌体载体，需要按载体对宿主菌遗传性状的不同要求，仔细选择合适的大肠杆菌的合适菌株，例如：野生型λ噬菌体可用C600菌株，Charon系列可用LE392菌株，λgt11可选用Y1090hsdR菌株，EMBL3-4可选用NM538菌株，λ2001，λDASH和λFIX可选用NM539菌株，λgt10扩增载体可选用C600菌株，筛选重组λgt10可选用BNN102菌株等等。感染后的宿主细胞在大体积培养基中培养，初期，因噬菌体的浓度低，未感染的细胞就在培养的开始几小时(3～4小时内)大量繁殖，而被感染的细胞随着感染和裂解的反复发生，最终使几乎全部的细胞均被裂解。只要最初感染时噬菌体和宿主细胞之间的比例合适，就可以得到足够量的噬菌体。对于不同型载体噬菌体和不同的宿主菌来说，感染时两者的最佳比例并不相同。合适的比例需实验者自己摸索。比例范围一般在1∶50～500之间不等。对于生长旺盛的λgtWES·λB，比率为1∶200，每1×1010细胞只需用5×107噬菌体去感染;而不易繁殖的Charon系列载体，比率是1∶20左右，相同数量的宿主细胞得用5×108噬菌体进行感染。 (一)λ噬菌体的平板培养和原种的制备 1.试剂的配制： LB培养基：于900ml水中加入10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠，溶解后用NaOH，调节pH到7.0，补水到1L，高压灭菌20分钟。 NZCYM培养基：于900ml水中加入NZ胺10g，NaCl5g，酪蛋白水解物1g，MgSO4·7H2O2g，用NaOH调整节pH到7.0，补水到1L，高压灭菌20分钟。 SM缓冲液：称量NaCl5.8g，MgSO4·7H2O2g，2%明胶溶液5ml，1mol/LTris-Cl(pH7.5)50ml。加水到1L。高压灭菌20分钟后，分装成50ml一份于灭菌小瓶中，可室温保存。 2.λ噬菌体的平板培养： (1)取一消毒的250ml烧瓶，加入50ml灭菌的含0.2%麦芽糖的加富培养液(如NZCYM或LB)，接种一个λ噬菌体的合适的受体菌株的单菌落，于37℃适度振摇(摇床250r/min)培养过夜。加麦芽糖后细菌更容易吸附λ噬菌体，因为λ噬菌体受体编码基因(lamB)位于麦芽糖操纵子内，而麦芽糖可诱导麦芽糖操纵子。 (2)于室温以4000g离心10分钟，倾出上清液，加入约20ml灭菌的0.01mol/LMgSO4溶液，振荡悬起细菌沉淀。 (3)用SM将噬菌体原种连续10倍稀释。取每个稀释度的噬菌体悬液0.1ml加入一灭菌试管(13mm×100mm)中。 (4)各加入0.1ml上述培养好的宿主菌，轻摇或振荡混匀。于37℃温育20分钟，使噬菌体颗粒吸附于细菌。 (5)取3ml熔化并于47℃保温的0.7%琼脂糖或琼脂加入第一支试管内，轻轻振荡后，立即倒入一含30～35ml凝固的底层琼脂培养基(NZCYM或LB)的平板内。注意勿产生气泡。轻轻晃动平板，以使细菌和顶层琼脂或顶层琼脂糖分布均匀。对其余的试管